La PCR cuantitativa fluorescente (qPCR) es una técnica de uso común en los laboratorios, que se puede aplicar al análisis de expresión genética, genotipado, detección de patógenos, análisis de SNP y más. El funcionamiento de la qPCR es simple y su principio es fácil de entender. Ahora, frente a una pila de datos desordenados, cómo analizar los resultados se convierte en una tarea abrumadora. Hoy, Xiao Yi le guiará sobre cómo simplificar procesos complejos y obtener fácilmente datos que se pueden publicar en revistas de SCI.
Los métodos de análisis más comunes utilizados en la qPCR incluyen la cuantificación relativa y la cuantificación absoluta, y la elección entre estos métodos debe basarse en diferentes diseños experimentales. En este número, nos centraremos en una aplicación común de la qPCR: el análisis de la expresión génica, donde generalmente se selecciona el método de cuantificación relativa.
Diseño experimental
Supongamos que actualmente necesitamos estudiar el efecto de la inducción de luz sobre la expresión del gen AtSUC2 de Arabidopsis. El grupo de control estaría formado por plantas de Arabidopsis que no han sido sometidas a ningún tratamiento, mientras que el grupo experimental estaría formado por plantas que han sido tratadas con una determinada inducción de luz. Se extraería ARN de ambos grupos y se realizaría una transcripción inversa para obtener ADNc, que luego se utilizaría como plantilla. El gen GAPDH de Arabidopsis se seleccionaría como referencia interna para el experimento de qPCR.
Los pocillos de qPCR que deben configurarse son los siguientes:
1) CNT (Sin control de plantilla) se utiliza para verificar si hay contaminación en el sistema de PCR.
2) TRN (Sin transcripción inversa) se refiere al uso de ARN que no ha sufrido transcripción inversa como plantilla, lo que sirve como control para la contaminación del ADNg.
3) El gen de referencia interna Se utiliza para corregir las diferencias causadas por la variación de las concentraciones iniciales de las muestras.
4) La selección de muestras de control Generalmente cae en las siguientes categorías:
- Para evaluar el efecto de un determinado tratamiento sobre la expresión genética, la muestra no tratada se utiliza como muestra de referencia.
- Para detectar las diferencias en la expresión genética en diferentes momentos, la muestra en el momento 0 se utiliza como muestra de referencia.
- Para comparar las diferencias en la expresión genética entre diferentes tejidos, se selecciona arbitrariamente un tejido como muestra de referencia.
Un punto a destacar aquí es que para cada material mencionado anteriormente, se han preparado 3 pocillos de PCR (1, 2, 3). Se trata de duplicados de PCR, también conocidos como réplicas técnicas, que tienen como objetivo eliminar errores operativos y evaluar con precisión la eficiencia de la amplificación. Además, es necesario establecer réplicas biológicas, que implican realizar el mismo experimento en diferentes materiales (diferentes tiempos, plantas, lotes, placas de reacción) para calibrar la variabilidad biológica y analizar si el tratamiento tiene significación estadística. En concreto, en este caso, tanto el grupo experimental como el grupo control requieren procesar al menos dos conjuntos más de muestras de Arabidopsis (A, B, C). De cada conjunto se extrae el ARN y se realiza la transcripción inversa, seguido de la qPCR. Para el análisis estadístico, se utiliza la media de las tres réplicas biológicas.
Análisis de resultados: método ΔΔCt
La característica del método ΔΔCt es que se basa únicamente en los valores de Ct para el cálculo, pero la premisa es que la eficiencia de amplificación del gen objetivo y del gen de referencia debe ser relativamente consistente y ambos deben estar dentro del rango del 90-110%.
La fórmula de cálculo específica es la siguiente:
ΔCt = Ct (gen objetivo) - Ct (gen de referencia)
ΔΔCt = ΔCt (grupo experimental) - ΔCt (grupo de control)
RQ = 2^(-ΔΔCt)
Suponiendo el experimento anterior que estudia el efecto de la inducción de luz en la expresión del gen AtSUC2 de Arabidopsis, los resultados de la qPCR son los siguientes:
Durante el cálculo, primero calculamos el promedio de los datos de 2^-△Ct para el grupo de control (como se muestra en la figura anterior, que es 0,00116). Luego, dividimos cada valor de 2^-△Ct por este promedio para obtener el valor de 2^-△△Ct. Finalmente, organizamos estos valores para obtener la media y la desviación estándar, lo que indica que el nivel de expresión del gen objetivo en el grupo experimental aumenta aproximadamente 9,73 veces en comparación con el grupo de control.
Los resultados se grafican utilizando el software Graphpad de la siguiente manera:
El valor P calculado mediante la prueba t del software es 0,0024, que es menor que 0,05, lo que indica una diferencia estadísticamente significativa y los resultados son confiables.
Análisis de resultados: método de curva estándar dual
En aplicaciones prácticas, dado que la eficiencia de amplificación del gen diana y del gen de referencia suele ser diferente, es necesario rediseñar los cebadores y optimizar las condiciones de reacción para lograr la misma eficiencia de amplificación. Sin embargo, también podemos optar por un método más conveniente, el enfoque de curva estándar dual.
Aquí, primero entendamos el método de análisis de cuantificación absoluta. Los pasos específicos son amplificar el fragmento objetivo a través de PCR, luego insertar el fragmento objetivo en un vector de clonación, extraer el plásmido recombinante y, después de que la secuenciación confirme que es correcto, se puede usar como estándar. La cantidad de ADN plasmídico se puede medir utilizando instrumentos como Nanodrop, y el número de copias se convierte en copias de plásmido específicas utilizando la fórmula de conversión de número de copias. Después de eso, el ADN se amplifica siguiendo una serie de diluciones. Se traza una curva estándar con el logaritmo del número de copias estándar como eje x y los valores Ct medidos como eje y. Con base en el valor Ct de la muestra desconocida, se puede calcular su número absoluto de copias.
Fórmula para calcular el número de copias:
Número de copias = (masa ÷ masa molecular relativa) × 6,02 × 10^23
El método de curva estándar dual implica la construcción por separado de muestras estándar para el gen objetivo y el gen de referencia, la realización de una cuantificación absoluta y la creación de curvas estándar. Después de calcular el número absoluto de copias de las muestras desconocidas, se realiza una comparación, lo que ofrece una mayor precisión.
La fórmula de cálculo específica es la siguiente:
Q = Número de copias del gen objetivo / Número de copias del gen de referencia
RQ = Q (experimental) / Q (control)
En el experimento mencionado anteriormente, que investiga el efecto de la inducción de luz en la expresión del gen AtSUC2 de Arabidopsis, se construyeron muestras estándar tanto para AtSUC2 como para GAPDH y se prepararon las siguientes curvas estándar:
Los valores de Ct para el gen objetivo y el gen de referencia interno en las muestras a analizar son los siguientes:
Durante el cálculo, en primer lugar, los valores Ct del gen diana y del gen de referencia interna se sustituyen en la relación lineal de la curva estándar para obtener los números absolutos de copias del gen diana y del gen de referencia interna tanto en el grupo experimental como en el de control. A continuación, utilizando la fórmula Q = número de copias del gen diana / número de copias del gen de referencia, se normaliza el nivel de expresión del gen diana.Finalmente, según la fórmula RQ = Q (experimental) / Q (control), el RQ se calcula en 9,71, lo que indica que el nivel de expresión del gen diana en el grupo experimental es 9,71 veces mayor que en el grupo control.
Los resultados se grafican utilizando el software GraphPad de la siguiente manera:
El valor P calculado mediante la prueba t del software es 0,0008, que es menor que 0,05, lo que indica una diferencia estadísticamente significativa y los resultados son confiables.
Con esto concluye el análisis de datos de qPCR de esta sesión. A continuación, recomendaré una gama de productos rentables para garantizar que sus datos experimentales sean más precisos y confiables. ¡Ven a recogerlos!
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