A pesar de haber obtenido buenos resultados durante la pandemia y de haber mostrado un gran potencial, la tecnología del ARNm aún presenta varias limitaciones, como tiempos de expresión cortos y una traducción proteica limitada. Si bien estas características pueden brindar un cierto nivel de seguridad, se convierten en limitaciones para terapias como la reposición proteica, que requiere dosis repetidas para mantener los niveles de expresión proteica, lo que introduce nuevos riesgos y desafíos como la inmunogenicidad y los anticuerpos neutralizantes.
El ARN autoamplificado (saRNA) puede generar la misma respuesta inmunitaria en dosis cientos o incluso miles de veces menores que las del ARNm tradicional. Las dosis más bajas implican menores costos de producción y las inyecciones menos frecuentes pueden reducir los posibles efectos secundarios tóxicos del ARNm y los vectores de administración. Actualmente, varios candidatos de saRNA han entrado en ensayos clínicos en todo el mundo. Grandes empresas como BioNTech están desarrollando activamente líneas de tecnología de saRNA.
Aunque el saRNA ofrece importantes ventajas en términos de costo y seguridad, su estructura única presenta nuevos desafíos de producción. La molécula de saRNA, que combina la secuencia que codifica la ARN polimerasa con la secuencia de la proteína diana, es mucho más grande (~10 kb) y más compleja (contiene más estructuras secundarias) que el ARNm tradicional. Esto aumenta significativamente la dificultad de las reacciones de transcripción in vitro, lo que reduce el rendimiento y la pureza de la producción de saRNA. Por lo tanto, la producción de saRNA exige estándares más altos en los procesos de síntesis, separación y purificación.
La cromatografía de afinidad, un método utilizado para la separación y purificación, presenta problemas como un bajo rendimiento e integridad del producto objetivo. La combinación de múltiples métodos de purificación cromatográfica (por ejemplo, agregando cromatografía de celulosa, cromatografía de fase inversa hidrófoba) es engorrosa, introduce nuevas impurezas, tiene bajas tasas de recuperación y es costosa. Además, el sistema de reacción IVT utilizado para la producción a gran escala está optimizado a partir de sistemas adecuados para sintetizar secuencias de ácidos nucleicos de 100 nt, lo que lo hace inadecuado para saRNA, que supera los 10 kb de tamaño. Esto requiere la optimización de los sistemas de reacción IVT existentes. Actualmente, los métodos de purificación de ARNm convencionales no pueden cumplir con los requisitos de calidad del líquido crudo industrial. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar y optimizar un proceso de separación y purificación de grado industrial completo y eficiente para el ARN autoamplificado.
Optimización de los métodos de producción y purificación industrial
Para desarrollar un sistema de producción industrial de ARNm autoamplificado (saRNA), es esencial optimizar primero los tipos de iones y componentes del tampón en el sistema de cotranscripción IVT a pequeña escala. Esto también implica refinar el tampón cromatográfico y las proporciones de lavado de la muestra para los procesos de purificación posteriores. Estas condiciones optimizadas se pueden ampliar luego a la producción a gran escala para verificar si el sistema puede aumentar eficazmente la capacidad de producción y mejorar la calidad del producto crudo.
Sistema de reacción de adición de tapa de cotranscripción
En el sistema de reacción de adición de tapa de cotranscripción, los componentes del tampón T7 incluyen 400 mM de HEPES, 20 mM de espermidina, 100 mM de DTT y sales de Mg2+.
Tampón T7: sal de iones de magnesio
El tipo de sal de iones de magnesio utilizada afecta el rendimiento y la integridad del producto saRNA objetivo.
- Para la síntesis de cotranscripción a pequeña escala de 1 mg de ARNm, el uso de Mg(OAc)2 como sal de Mg2+ da como resultado el mejor rendimiento e integridad, con valores de 100,5 µg y 62,9 %, respectivamente.
- Por el contrario, el uso de otras sales de iones de magnesio como MgCl2 y MgSO4 reduce el rendimiento en aproximadamente un 25-50% y la integridad en aproximadamente un 10%, lo que reduce significativamente tanto el rendimiento como la integridad.
Tampón T7: concentración de iones de magnesio
Una concentración óptima de iones de acetato de magnesio (30-50 mM) mejora el rendimiento y la integridad del saRNA objetivo, con los mejores resultados a 35 mM.
- A una concentración de iones de acetato de magnesio de 30-50 mM, el rendimiento de saRNA alcanza 88,5-100,5 µg y la integridad es del 58,6-62,9%, mostrando buenos resultados.
- A una concentración de 35 mM, el rendimiento y la integridad son máximos, alcanzando 100,5 µg y 62,9 %, respectivamente.
Tampón T7: sal de iones de magnesio combinada con otras sales
Agregar otras sales al tampón T7 puede mejorar significativamente el rendimiento y la integridad del producto objetivo.
- El tampón base T7 incluye 400 mM de HEPES, 20 mM de espermidina, 100 mM de DTT y sales de Mg2+, lo que da como resultado un rendimiento e integridad de 100,5 µg y 62,9 %, respectivamente.
- La adición de una segunda sal, NaOAc, mejora aún más el rendimiento y la integridad: el rendimiento aumenta entre 20 y 110 µg y la integridad mejora entre un 2 y un 8 %.
Tampón T7: concentración de sales combinadas
Cuando el segundo componente de sal NaOAc (Na+) está en una concentración de 5-30 mM, el rendimiento y la integridad del saRNA objetivo mejoran significativamente, con la mejor concentración a 15 mM.
- En concentraciones de Na+ de 3-30 mM, el rendimiento de saRNA alcanza 120-210 µg y la integridad es del 64,4-70,2%, mostrando buenos resultados.
- A una concentración de Na+ de 15 mM, el rendimiento y la integridad son máximos, alcanzando 210 µg y 70,2 %, respectivamente.
Métodos de purificación únicos
Durante la producción y purificación de ARNsa a pequeña escala (<50 mg), el uso de diferentes métodos de purificación puede reducir significativamente el contenido de ARNbc y los residuos de proteínas, lo que garantiza un alto rendimiento, eficiencia de recubrimiento e integridad del producto. La eficacia de los métodos de purificación, de mejor a peor, es: cromatografía de afinidad > precipitación con cloruro de litio > ultrafiltración, cromatografía de celulosa.
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Cromatografía de afinidad
Para la producción de ARNm a gran escala, se prefiere la cromatografía. Las opciones incluyen cromatografía de fase inversa, de intercambio iónico, hidrofóbica y de afinidad, cada una con sus pros y sus contras. La cromatografía de afinidad, que se utiliza a menudo para capturar ARNm poli(A), ofrece escalabilidad y soluciones de plataforma con tasas de recuperación >90%.
Las características estructurales clave del ARNm, la tapa 5' y la cola poli(A) 3', facilitan la purificación. La cromatografía de afinidad, similar a la purificación con perlas magnéticas, utiliza perlas unidas a dT para capturar el ARNm de la cola poli(A). Las condiciones de alta concentración de sal protegen las cargas negativas, lo que permite la unión a través de enlaces de hidrógeno AT, y el ARNm se eluye en condiciones de pH neutro suave y baja conductividad.
La cromatografía de afinidad para ARN implica una "alta unión de sal y una baja elución de sal". La composición del tampón, el tamaño molecular, la temperatura y la concentración de la muestra afectan significativamente el proceso. Seleccionar el tipo y la concentración de sal óptimos mediante experimentación es esencial para una purificación eficiente.
Purificación: Este método produce la mayor integridad del producto (80,3%), el menor contenido de dsRNA (0,01 µg/mg), la mayor eficiencia de tapado (96,4%) y la menor cantidad de residuos de proteína (1,20 µg/mg), con un rendimiento de 136 µg y una tasa de recuperación del 65%, lo que lo convierte en el mejor en términos de pureza y calidad del producto.
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Otros métodos de purificación:
Precipitación de cloruro de litio
El principio de purificación de ARNm con LiCl es que el litio puede reducir la repulsión electrostática entre moléculas a un pH determinado, lo que permite una precipitación eficiente del ARN.El precipitado se separa luego por centrifugación y se disuelve para obtener una muestra de ARN puro. La precipitación con LiCl es simple, rápida y eficaz para ARNm de varios tamaños y produce productos de alta pureza. Sin embargo, los iones de litio residuales pueden inhibir el ARNm. Se recomienda utilizar la precipitación con LiCl para soluciones que contengan al menos 400 µg/ml de ARN para garantizar la eficiencia de la purificación. Este método produce un alto rendimiento (210 µg), pero la integridad del producto es de solo el 70,2 %, lo que reduce significativamente la calidad del producto. No es adecuado para la producción a gran escala.
Método de perlas magnéticas:
Las perlas magnéticas son pequeñas partículas que se mueven direccionalmente bajo un campo magnético, generalmente compuestas por un núcleo de óxido de hierro y un revestimiento externo. La purificación con perlas magnéticas es una técnica común de biología molecular para enriquecer de manera rápida y eficiente las moléculas de ARNm a partir de mezclas. Las diferentes perlas magnéticas funcionales tienen diferentes grupos funcionales de superficie (por ejemplo, hidroxilo, carboxilo, oligo(dT), estreptavidina) para purificar varias biomoléculas.
Las perlas magnéticas carboxiladas pueden purificar eficazmente los ácidos nucleicos, y las moléculas de ARNm se unen a través de interacciones electrostáticas en condiciones ácidas. El ajuste de las condiciones permite la unión y liberación selectivas del ARNm. Los ARNm más largos con grupos fosfato con carga negativa más expuestos se unen más fácilmente a las perlas. Para ARNm más cortos, pueden necesitarse volúmenes de perlas mayores. Las perlas magnéticas acopladas a oligo(dT), de manera similar a la cromatografía de afinidad, utilizan la unión específica entre la cola de poli(A) del ARNm y el oligo(dT) de las perlas.
Ultrafiltración
Este método da como resultado la integridad de saRNA más baja, aproximadamente un 8 % menor que la cromatografía de afinidad, con el residuo de proteína más alto (4,58 µg/mg).
Cromatografía de celulosa
Este método logra un bajo contenido de dsRNA (0,009 µg/mg) y una alta tasa de recubrimiento (96,4 %). Sin embargo, los residuos de proteína son ligeramente más altos (5,30 µg/mg), con una tasa de recuperación de solo el 57 % y un rendimiento de 120 µg, ambos significativamente inferiores a los logrados con la cromatografía de afinidad (en aproximadamente un 10 % y 16 µg, respectivamente).
Proceso de purificación
Componentes del tampón cromatográfico: adición de agentes reductores
La adición de agentes reductores al tampón cromatográfico durante la purificación puede mejorar significativamente la integridad del producto, la tasa de recuperación y la eficiencia de tapado, al tiempo que reduce los niveles de subproductos de ARNbc y residuos de proteínas en comparación con no agregar agentes reductores.
- Sin agentes reductores:
- Rendimiento: 136 µg
- Tasa de recuperación: 65%
- Integridad: 80,3%
- ARNbc: 0,01 µg/mg
- Eficiencia de tapado: 96,4%
- Residuo de proteína: 1,20 µg/mg
- La pureza y la calidad del producto son buenas.
- Con agentes reductores (TCPE, DTT, β-mercaptoetanol):
- El rendimiento aumenta entre 10 y 40 µg.
- La tasa de recuperación aumenta entre un 5 y un 18 %
- La integridad mejora aproximadamente entre un 1 y un 5 %
- Eficiencia de tapado: 96,4%
- dsRNA: tan solo 0,005 µg/mg
- Residuo de proteína: tan bajo como 0,20 µg/mg
- Mejora significativa en la pureza y calidad del producto.
Componentes del tampón cromatográfico: tipos de agentes reductores
Los distintos tipos de agentes reductores añadidos al tampón cromatográfico pueden mejorar aún más la integridad del producto, la tasa de recuperación y la eficiencia de la protección, al tiempo que reducen los residuos de ARN bicatenario y de proteínas. Se ha descubierto que el TCPE es el agente reductor más eficaz.
- Con TCPE:
- Rendimiento: 175 µg
- Tasa de recuperación: 83%
- Integridad: 85,2%
- ARNbc: 0,005 µg/mg
- Eficiencia de tapado: 96,4%
- Residuo de proteína: 0,20 µg/mg
- Excelente pureza y calidad del producto.
Componentes del tampón cromatográfico: concentración de agentes reductores
La adición de agentes reductores en una concentración de 5 a 15 mM en el tampón cromatográfico puede mejorar significativamente la integridad del producto, la tasa de recuperación y la eficiencia de la protección, al tiempo que reduce los residuos de ARN bicatenario y de proteínas. La concentración óptima es de 10 mM.
- Añadiendo 5-15 mM de TCPE:
- Rendimiento: 160-178µg
- Tasa de recuperación: 76-85%
- Integridad: aproximadamente 85%
- ARNbc: 0,002-0,005 µg/mg
- Eficiencia de tapado: 96,4%
- Residuo de proteína: 0,20-0,52 µg/mg
- Buena pureza y calidad del producto.
- Con 10 mM de TCPE:
- Rendimiento: 178 µg
- Tasa de recuperación: 85%
- Integridad: 85,4%
- ARNbc: 0,002 µg/mg
- Eficiencia de tapado: 96,4%
- Residuo de proteína: 0,20 µg/mg
- Óptima pureza y calidad del producto.
Proporción de lavado
El control de la proporción de tampón cromatográfico y agua de inyección en el proceso de lavado (10-25):(75-90) puede mejorar significativamente la integridad del producto, la tasa de recuperación y la eficiencia de la protección, al tiempo que reduce los residuos de ARN bicatenario y proteínas. La proporción óptima es 15:85.
- Relación (10-25):(75-90):
- Rendimiento: 150-179 µg
- Tasa de recuperación: 71-85%
- Integridad: 84-90%
- ARNbc: 0,002-0,006 µg/mg
- Eficiencia de tapado: 96,4%
- Residuo de proteína: aproximadamente 0,20 µg/mg
- Buena pureza y calidad del producto.
- Con una relación de aspecto de 15:85:
- Rendimiento: 179 µg
- Tasa de recuperación: 85%
- Integridad: 90,0%
- ARNbc: 0,002 µg/mg
- Eficiencia de tapado: 96,4%
- Residuo de proteína: 0,20 µg/mg
- Óptima pureza y calidad del producto.
Métodos de purificación combinados
El uso de una combinación de diferentes métodos de purificación puede reducir aún más los niveles de ARN bicatenario y residuos de proteínas en el producto, mejorando así la calidad general. El orden preferido de los métodos de purificación es: cromatografía de afinidad > ultrafiltración + cromatografía de afinidad > cromatografía de afinidad + cromatografía de celulosa > cromatografía de celulosa + ultrafiltración. La cromatografía de afinidad por sí sola proporciona los mejores resultados.
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Cromatografía de afinidad sola:
- Rendimiento: 179 µg
- Tasa de recuperación: 85%
- Integridad: 90,0%
- ARNbc: 0,002 µg/mg
- Eficiencia de tapado: 96,4%
- Residuo de proteína: 0,20 µg/mg
- Máxima pureza y calidad del producto.
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Ultrafiltración + Cromatografía de afinidad:
- Rendimiento: 170 µg (9 µg menos que la cromatografía de afinidad sola)
- Tasa de recuperación: 81% (4% menos que la cromatografía de afinidad sola)
- Integridad: 88,5%
- ARNbc: 0,0015 µg/mg
- Residuo de proteína: 0,18 µg/mg
- Ligera reducción de los residuos de ARN de doble cadena y de proteínas en comparación con la cromatografía de afinidad sola, pero significativa reducción del rendimiento y de la tasa de recuperación. Este método es más complejo, duplica el tiempo de purificación y aumenta los costos.
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Cromatografía de afinidad + Cromatografía de celulosa / Cromatografía de celulosa + Ultrafiltración:
- dsRNA: 0,005 µg/mg menos que los métodos individuales
- Rendimiento: 60-100 µg menos
- Tasa de recuperación: 30-40% menor
- El aumento de pasos implica mayores costos de mano de obra y materiales.
Producción a gran escala
En la producción a gran escala, utilizando cromatografía de afinidad, cromatografía de afinidad combinada con cromatografía de celulosa o ultrafiltración combinada con cromatografía de afinidad, el rendimiento de ARNm autoamplificado aumenta significativamente a 140-185 µg, con una tasa de recuperación del 67-88%. La integridad del producto es del 93-94%, el contenido de dsRNA se controla dentro de 0,0018-0,0020 µg/mg, la eficiencia de tapado alcanza el 96,1-96,4% y los residuos de proteína se mantienen dentro de 0,04-0,05 µg/mg. Esto demuestra una buena escalabilidad y eficiencia para la producción a gran escala.
Referencia:
[8] Métodos de producción industrial y purificación por separación de líquido crudo de ARNm autoamplificante y sus aplicaciones [P]. Patente: CN118048418A. 17.05.2024.
Información de pedidos
Yeasen desarrolló una novedosa ARN polimerasa CleaScrip™ T7, que es una enzima de primer nivel para la síntesis de ARNm. Por ello, ya no es necesario el tratamiento con celulosa para la eliminación del dsRNA, lo que permite ahorrar tiempo y costes de mano de obra. El contenido de dsRNA en los ARNm producidos por la ARN polimerasa T7 de CleaScript™ es menor que el de los ARNm producidos por la ARN polimerasa T7 de tipo salvaje, tanto antes como después del paso de eliminación del dsRNA mediante el tratamiento con celulosa. Ver más detalles desde los siguientes enlaces: