La estructura Cap es un componente esencial en el desarrollo de vacunas y terapias de ARNm. La tecnología de ARNm sintético se basa en Cap1 para mejorar la estabilidad, la eficiencia de la traducción y reducir el reconocimiento inmunológico innato del ARNm por parte de los receptores tipo Toll (TLR) y otros sensores inmunológicos, lo que minimiza la activación inmunitaria no deseada. Esto evita respuestas inflamatorias no deseadas, mejorando así la estabilidad y la eficacia del ARNm terapéutico en las células humanas.
Descubrimiento temprano y estructura de Cap0
A mediados de la década de 1970, las investigaciones sobre el ARNm eucariota descubrieron una estructura terminal 5' ahora conocida como Cap0, donde una tapa N7-metilguanosina (m7G) está unida al primer nucleótido en el extremo 5'. Se descubrió que esta modificación protegía al ARNm de la degradación por exonucleasas, ayudaba en la exportación nuclear y promovía el reconocimiento de los ribosomas para el inicio de la traducción. Cap0 fue la primera estructura de tapa caracterizada, con su metilación limitada a la propia tapa de guanosina. El descubrimiento de esta tapa 5' y sus funciones marcó un avance significativo en la comprensión de las tapas del ARNm eucariota y su papel en las modificaciones del ARNm.
El surgimiento de Cap1
La estructura Cap1, una característica fundamental del ARNm eucariota, desempeña un papel fundamental en la estabilidad, la traducción y el reconocimiento inmunitario del ARNm. La estructura de la caperuza del ARNm, que consiste en una N7-metilguanosina (m7G) unida al primer nucleótido a través de un enlace trifosfato 5'-5', evolucionó a partir de los primeros estudios sobre modificaciones postranscripcionales del ARNm eucariota en la década de 1970.
Estructura de los ARNm con capuchón en el extremo 5′.【1】 Investigaciones posteriores revelaron que en la mayoría de los ARNm eucariotas, el primer nucleótido después del capuchón (posición +1) también está metilado en la posición 2'-O de la ribosa, un proceso conocido como metilación 2'-O. Este descubrimiento, conocido como la estructura Cap1 (m7GpppNm), agregó otra capa de importancia funcional a las modificaciones del ARNm. Se descubrió que la modificación Cap1 afinaba la estabilidad del ARNm y evitaba el reconocimiento inmunológico por parte del sistema inmunológico innato, particularmente en células de mamíferos, donde ayuda a evadir el reconocimiento por parte de receptores de reconocimiento de patrones como RIG-I, TLR y MDA5【2】. Esto fue crucial tanto para el metabolismo del ARNm como para el avance de las tecnologías basadas en el ARNm, incluidas las aplicaciones de la vacunación con ARNm y la terapia génica.
Desafíos técnicos en la industria del ARNm y soluciones actuales
Aún quedan varios desafíos técnicos en la aplicación generalizada y la optimización de las vacunas de ARNm, incluidos problemas con el ARNm en dosis altas, las respuestas inmunitarias, la estabilidad y la administración. Un desafío importante en la industria del ARNm es la necesidad de altas dosis de ARNm para provocar una respuesta inmunitaria sólida. Esto se debe a varios factores:
Degradación rápida: El ARNm es inherentemente inestable y susceptible a la degradación por enzimas decapantes y ribonucleasas (ARNasas) presentes en los sistemas biológicos.
Eficiencia traduccional limitada: La eficiencia con la que el ARNm se traduce en proteína puede variar, requiriendo mayores cantidades de ARNm para generar niveles de antígeno suficientes para una respuesta inmunitaria. La eficiencia de la traducción está relacionada con la afinidad de Cap1 y el factor de iniciación de la traducción eIF4E.
La formación del complejo básico de iniciación de la traducción en eucariotas.【3】
Inmunogenicidad y reacciones inmunes no deseadas: El tercer obstáculo más importante es la respuesta inmunitaria innata que puede desencadenarse por el propio ARNm, especialmente en el caso del ARNdc o del ARNm incompleto. Si bien se desea un cierto nivel de activación inmunitaria para estimular el sistema inmunitario adaptativo, una activación excesiva puede provocar respuestas inflamatorias, que pueden reducir la eficacia de la vacuna o causar efectos secundarios.
Historia de la tecnología de tapado
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Tecnología de tapado enzimático: La protección enzimática, introducida en los primeros días de la investigación del ARNm, implica el uso de enzimas de protección como la guanililtransferasa y la metiltransferasa para agregar una protección natural en el extremo 5' después de la transcripción. Este método garantiza una alta fidelidad y eficiencia de protección en la traducción del ARNm, en particular para aplicaciones terapéuticas.
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Análogos de tapas sintéticas (década de 1980-2000): Los investigadores desarrollaron análogos sintéticos de capuchón para la síntesis in vitro de ARNm con capuchón, lo que ayuda a estudiar la función del ARNm y la expresión génica. El análogo de capuchón antirreverso (ARCA) es un análogo sintético de capuchón diseñado para evitar la incorporación incorrecta del capuchón durante la síntesis de ARNm, lo que mejora la eficiencia de la traducción del ARNm para vacunas y terapias génicas. Sin embargo, la eficiencia y el rendimiento del capuchón ARCA son bajos.
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Tecnología Cap1 (década de 2010): Cap1 de TriLink es un método de cotranscripcionalización que simplifica el proceso al incorporar la tapa directamente durante la síntesis de ARNm. Este método mejora la eficiencia y produce un alto porcentaje de ARNm con la tapa correctamente colocada, lo que lo hace ideal para aplicaciones terapéuticas a gran escala, como las vacunas de ARNm.
En la actualidad, las tecnologías de recubrimiento enzimático han sido fundamentales en el desarrollo de terapias basadas en ARNm, incluidas las vacunas contra la COVID-19, garantizando la estabilidad y la traducción efectiva del ARNm terapéutico.
Comparación del tapado enzimático, la próxima generación Capping LZCap y el método Capping de primera generación (ARCA)
Desarrollo de análogos de tapa de próxima generación
Nuestro objetivo era desarrollar análogos de capuchón con resistencia a las enzimas decapantes, alta afinidad con eIF4E para mejorar la eficiencia de la traducción y menor inmunogenicidad. Estos avances son cruciales para mejorar la eficacia de las terapias basadas en ARNm, incluidos los tratamientos contra el cáncer y las aplicaciones de terapia génica.
Diseño de LZCap
Al diseñar LZCap, nos centramos principalmente en crear un análogo de capuchón con alta afinidad por eIF4E. Las enzimas tienen un reconocimiento relativamente "específico" de los sustratos. Por lo tanto, al diseñar una nueva estructura de capuchón, nos esforzamos por mantener la similitud con las estructuras naturales/conocidas tanto como sea posible. La estructura natural tiene un OH de ribosa 3', que se puede modificar (por ejemplo, metilación). Con base en esta consideración, elegimos agregar un carbono en la posición 3' para darle novedad, seguido de un NH para imitar el enlace de hidrógeno del OH, y luego un grupo acetilo para reducir la basicidad del NH y mejorar su capacidad de enlace de hidrógeno. La actividad de LZCap es mejor que la del capuchón natural metilado, posiblemente debido al aumento del enlace de hidrógeno. En comparación con los grupos metilo y metoxi, el grupo acetilamino también puede aumentar las interacciones de van der Waals entre el sustrato (capuchón) y el factor iniciador (enzima).
Estabilidad del grupo acetilamino
El grupo acetilamino ya es suficientemente estable. Es mucho más estable que la posición 7-metilada y el enlace fosfodiéster, que son las partes menos estables del casquete.
Rendimiento y eficiencia de tapado de LZCap
Con la tapa LZCap AG(3'Acm), la eficiencia de tapado del ARNm de la luciferasa es de aproximadamente el 97,59%, y se pueden obtener hasta 200 μg de ARNm tapado con 1 μg de ADN molde en una reacción de transcripción in vitro (IVT) estándar con la ARN polimerasa T7. La pureza del ARNm es de hasta el 99% después de una simple precipitación con LiCl. Esta alta eficiencia de tapado y rendimiento hacen de LZCap una opción atractiva para diversas aplicaciones, incluida la producción de proteínas y la terapia génica.
La estructura Cap es un componente esencial en el desarrollo de vacunas y terapias de ARNm.La tecnología de ARNm sintético se basa en Cap1 para mejorar la estabilidad y la eficiencia de la traducción y reduce el reconocimiento inmunitario innato del ARNm por parte de los receptores tipo Toll (TLR) y otros sensores inmunitarios, lo que minimiza la activación inmunitaria no deseada. Esto evita respuestas inflamatorias no deseadas, mejorando así la estabilidad y la eficacia del ARNm terapéutico en las células humanas.
| Producto | Tapa Estado (3'-OhYo-7mG) | LZCap AG(3'Acm) | Estado (sin límite) |
| Rendimiento de ARNm (μg) | 164 | 173 | 200 |
Análisis de MS de la eficiencia de recubrimiento del ARNm de la luciferasa LZCapped con un método basado en la ARNasa H. La eficiencia de recubrimiento es de aproximadamente el 97,59 %.
¿Cómo es la estabilidad del ARNm frente a la enzima decapadora?
Los ARNm con LZCap AG(3'Acm) y LZCap AG M6 (3'Acm) muestran una mayor resistencia a la enzima decapante (NEB). Se observa que CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) también es resistente a la enzima decapante, pero el Cap AG normal (3'-OMe-7mG) no muestra resistencia.
¿Cómo es la afinidad de unión de LZCap a eIF4E?
¿Qué tal la expresión proteica del ARNm con capuchón LZCap AG(3'Acm)?
La expresión del ARNm de la luciferasa con capuchón LZCap AG(3'Acm) es significativamente mayor que la del ARNm con capuchón análogo de Cap1 (3'-OMe-7mG) en diferentes líneas celulares* (3T3-L1, Hela, JAWs, HEK293T y Huh7). El experimento de 130 repeticiones mostró una expresión de aproximadamente 1,5 veces mayor del ARNm de la luciferasa con capuchón LZCap AG(3'Acm) que del ARNm con capuchón (3'-OMe-7mG) en promedio. Se observa un resultado similar en ratones. El nivel de expresión de proteínas puede variar ligeramente con diferentes secuencias de ARNm.
¿Tienes más datos sobre animales?
La eficiencia de expresión de LZCap AG(3'Acm) o LZCap AG(3'FMom) capped
El ARNm que codifica GLuc muestra una mayor expresión in vivo en relación con los ARNm con capuchón CapAG (3'-OMe-7mG) en el mono cinomolgus y el cerdo.
¿Qué tal la inmunogenicidad innata de los ARNm con capuchón LZCap AG?
Los ARNm con capuchón LZCapAG (3'Acm) muestran una inmunogenicidad innata baja. TLR8, TLR7, IL-1A y B desempeñan un papel importante en la respuesta inmunitaria inducida por el ARN sin capuchón. Los estudios in vivo del análisis de inmunogenicidad del ARNm LZCapped mostraron que el ARN sin capuchón provocó cambios significativos en el nivel de transcripción de factores relacionados con el sistema inmunitario en ratones. Tanto los ARNm con capuchón LZCap como los 3'-OMe-7mG muestran un nivel de transcripción de factores inmunitarios similarmente inferior en ratones después de una única inyección estimulada con ARN.
¿Hiciste alguna prueba de seguridad?
Sí, hicimos pruebas de citotoxicidad, estudio de inhibición de la polimerasa humana y prueba de Ames.
- No se observó citotoxicidad o se observó poca para el monómero nucleósido de 3'-Acm-7mG（CC50＞10000nM） en células 293T, Huh7, MRC5, THP1 y U87MG.
- ADN polimerasa humana ( α ,β , gamma Los estudios de inhibición de la actividad de la ARN polimerasa mitocondrial (hPOLRMT) y de Klenow muestran que 3'-Acm-7mG TP no inhibe la ADN o la ARN polimerasa humana.
- La prueba de mutación inversa bacteriana (Ames) detecta alteraciones genéticas asociadas, así como carcinógenos genotóxicos en la mayoría de los roedores y humanos. La prueba de Ames demostró que el 3'-Acm-7mG no tiene genotoxicidad.
¿Este producto ha sido patentado?
Sí. La patente ha sido concedida en Estados Unidos.
Información de pedidos
| Nombre del producto | Presupuesto | N.º de catálogo |
| LZCap AG(3'Acm)（ 100 mM) | 100 μl, 1 ml | 10684ES |
| LZCap AU(3'Acm)（ 100 mM） | 100 μl, 1 ml | 10685ES |
| LZCap GG(3'Acm)（ 100 mM) | 100 μl, 1 ml | 10686ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy5)（ 25 mM) | 100 μl, 1 ml | 10688ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy7)（ 25 micras） | 100 μl, 1 ml | 10689ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 mM) | 100 μl, 1 ml | 10687ES |
| LZCap (AG(3'Ma-biotina) (25 mM) | 100 μl, 1 ml | Consulta |
| LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 mM) | 100 μl, 1 ml | Consulta |
| LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 mM) | 100 μl, 1 ml | Iconsulta |
| LZCap (AG(3'Acm) ARNm de luciérnaga (1 μg/μL) | 100 μl, 1 ml | Iconsulta |
| LZCap (AG(3'Acm) ARNm de eGFP (1 μg/μL) | 100 μl, 1 ml | Iconsulta |
| LZCap (AG(3'Acm) ARNm saGFP (1 μg/μL) | 100 μl, 1 ml | Iconsulta |
| ARNm de RFP LZCap (AG(3'Acm) (1 μg/μL) | 100 μl, 1 ml | Consulta |
| LZCap (AG(3'Acm) ARNm de Cas9 (1 μg/μL) | 100 μl, 1 ml | Iconsulta |
| ARNm de LZCap (AG(3'Acm) Gluc (1 μg/μL) | 100 μl, 1 ml | Iconsulta |
Referencia:
- Mecanismos moleculares de la metilación y el recubrimiento del ARN del coronavirus, Virologica Sinica 31(1)
- Vacunas de ARNm: una nueva era en vacunología. Nat. Rev. Droga. Descubrimiento. 17, 261–279 (2018).
- Iniciación de la traducción regulada por la proteína de unión al ARN en mamíferos: modulación del complejo de iniciación de la traducción por factores que actúan en trans, células 2021, 10(7), 1711