La estructura Cap es un componente esencial en el desarrollo de vacunas y terapias de ARNm. La tecnología de ARNm sintético se basa en Cap1 para mejorar la estabilidad y la eficiencia de la traducción, y reducir el reconocimiento inmunitario innato del ARNm por los receptores tipo Toll (TLR) y otros sensores inmunitarios, minimizando así la activación inmunitaria no deseada. Esto previene respuestas inflamatorias indeseadas, mejorando así la estabilidad y la eficacia del ARNm terapéutico en las células humanas.
Descubrimiento temprano y estructura de Cap0
A mediados de la década de 1970, la investigación sobre el ARNm eucariota reveló una estructura terminal 5', ahora conocida como Cap0, donde una caperuza de N7-metilguanosina (m7G) se une al primer nucleótido del extremo 5'. Se descubrió que esta modificación protege al ARNm de la degradación por exonucleasas, facilita la exportación nuclear y promueve el reconocimiento ribosomal para el inicio de la traducción. Cap0 fue la primera estructura de caperuza caracterizada, con su metilación limitada a la propia caperuza de guanosina. El descubrimiento de esta caperuza 5' y sus funciones marcó un avance significativo en la comprensión de las caperuzas del ARNm eucariota y su papel en las modificaciones del ARNm.
El surgimiento de Cap1
La estructura Cap1, una característica crucial del ARNm eucariota, desempeña un papel fundamental en la estabilidad, la traducción y el reconocimiento inmunitario del ARNm. La estructura de la caperuza del ARNm, compuesta por una N7-metilguanosina (m7G) unida al primer nucleótido mediante un enlace trifosfato 5'-5', evolucionó a partir de estudios iniciales sobre modificaciones postranscripcionales del ARNm eucariota en la década de 1970.
Estructura de los ARNm con capuchón en el extremo 5′.【1】 Investigaciones posteriores revelaron que en la mayoría de los ARNm eucariotas, el primer nucleótido después del capuchón (posición +1) también está metilado en la posición 2'-O de la ribosa, un proceso conocido como 2'-O-metilación. Este descubrimiento, conocido como la estructura Cap1 (m7GpppNm), añadió otra capa de importancia funcional a las modificaciones del ARNm. Se descubrió que la modificación Cap1 afina la estabilidad del ARNm e impide el reconocimiento inmunitario por parte del sistema inmunitario innato, en particular en células de mamíferos, donde ayuda a evadir el reconocimiento por parte de receptores de reconocimiento de patrones como RIG-I, TLR y MDA5【2】. Esto fue crucial tanto para el metabolismo del ARNm como para el avance de las tecnologías basadas en ARNm, incluidas las aplicaciones de vacunación con ARNm y terapia génica.
Desafíos técnicos en la industria del ARNm y soluciones actuales
Aún persisten varios desafíos técnicos en la aplicación generalizada y la optimización de las vacunas de ARNm, incluyendo problemas con el ARNm en dosis altas, la respuesta inmunitaria, la estabilidad y la administración. Un desafío importante en la industria del ARNm es la necesidad de altas dosis de ARNm para generar una respuesta inmunitaria robusta. Esto se debe a varios factores:
Degradación rápida: El ARNm es inherentemente inestable y susceptible a la degradación por enzimas decapantes y ribonucleasas (ARNasas) presentes en los sistemas biológicos.
Eficiencia de traducción limitada: La eficiencia con la que el ARNm se traduce a proteína puede variar, requiriendo mayores cantidades de ARNm para generar niveles suficientes de antígeno para una respuesta inmunitaria. La eficiencia de la traducción está relacionada con la afinidad de Cap1 y el factor de iniciación de la traducción eIF4E.
La formación del complejo básico de iniciación de la traducción en eucariotas.【3】
Inmunogenicidad y reacciones inmunes no deseadas: El tercer mayor obstáculo es la respuesta inmunitaria innata, que puede ser desencadenada por el propio ARNm, especialmente en el caso del ARNdc o ARNm incompleto. Si bien se desea cierto nivel de activación inmunitaria para estimular el sistema inmunitario adaptativo, una activación excesiva puede provocar respuestas inflamatorias, lo que puede reducir la eficacia de la vacuna o causar efectos secundarios.
Historia de la tecnología de tapado
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Tecnología de tapado enzimático: La caperuza enzimática, introducida en los inicios de la investigación del ARNm, implica el uso de enzimas de caperuza como la guanililtransferasa y la metiltransferasa para añadir una caperuza natural en el extremo 5' postranscripcional. Este método garantiza una alta fidelidad y eficiencia de caperuza en la traducción del ARNm, especialmente para aplicaciones terapéuticas.
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Análogos de tapas sintéticas (décadas de 1980 a 2000): Los investigadores desarrollaron análogos sintéticos de capuchón para la síntesis in vitro de ARNm con capuchón, lo que facilita el estudio de la función del ARNm y la expresión génica. El análogo de capuchón antirreverso (ARCA) es un análogo sintético de capuchón diseñado para prevenir la incorporación incorrecta del capuchón durante la síntesis de ARNm, mejorando así la eficiencia de la traducción del ARNm para vacunas y terapias génicas. Sin embargo, la eficiencia y el rendimiento del capuchón ARCA son bajos.
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Tecnología Cap1 (década de 2010): El método de capping cotranscripcional Cap1 simplifica el proceso al incorporar la caperuza directamente durante la síntesis de ARNm. Este método mejora la eficiencia y produce un alto porcentaje de ARNm correctamente caperuzado, lo que lo hace ideal para aplicaciones terapéuticas a gran escala, como las vacunas de ARNm.
Actualmente, las tecnologías de recubrimiento enzimático han sido fundamentales en el desarrollo de terapias basadas en ARNm, incluidas las vacunas contra la COVID-19, garantizando la estabilidad y la traducción efectiva del ARNm terapéutico.
Comparación del recubrimiento enzimático, la próxima generación Capping LZCap y el método de Capping de primera generación (ARCA)
Desarrollo de análogos de tapa de próxima generación
Nuestro objetivo era desarrollar análogos de capuchón resistentes a las enzimas de decapuchón, con alta afinidad por eIF4E para mejorar la eficiencia de la traducción y una menor inmunogenicidad. Estos avances son cruciales para mejorar la eficacia de las terapias basadas en ARNm, incluyendo tratamientos contra el cáncer y aplicaciones de terapia génica.
Diseño de LZCap
Al diseñar LZCap, nos centramos principalmente en crear un análogo de capuchón con alta afinidad por eIF4E. Las enzimas reconocen los sustratos de forma relativamente específica. Por lo tanto, al diseñar una nueva estructura de capuchón, buscamos mantener la mayor similitud posible con las estructuras naturales/conocidas. La estructura natural presenta un OH 3' de ribosa, que puede modificarse (p. ej., mediante metilación). Con base en esta consideración, optamos por añadir un carbono en la posición 3' para mayor novedad, seguido de un NH para imitar el enlace de hidrógeno del OH, y finalmente un grupo acetilo para reducir la basicidad del NH y mejorar su capacidad de enlace de hidrógeno. La actividad de LZCap es superior a la de un capuchón natural metilado, posiblemente debido a un mayor enlace de hidrógeno. En comparación con los grupos metilo y metoxi, el grupo acetilamino también puede aumentar las interacciones de van der Waals entre el sustrato (capuchón) y el factor iniciador (enzima).
Estabilidad del grupo acetil amino
El grupo acetilamino ya es suficientemente estable. Es mucho más estable que la posición 7-metilada y el enlace fosfodiéster, que son las partes menos estables de la tapa.
Rendimiento y eficiencia de tapado de LZCap
Con la caperuza LZCap AG(3'Acm), la eficiencia de caperuza del ARNm por luciferasa es de aproximadamente el 97,59 %, y se pueden obtener hasta 200 μg de ARNm caperuza con 1 μg de ADN molde en una reacción estándar de transcripción in vitro (IVT) con la ARN polimerasa T7. La pureza del ARNm alcanza el 99 % tras una simple precipitación con LiCl. Esta alta eficiencia de caperuza y rendimiento convierten a LZCap en una opción atractiva para diversas aplicaciones, como la producción de proteínas y la terapia génica.
La estructura Cap es un componente esencial en el desarrollo de vacunas y terapias de ARNm.La tecnología de ARNm sintético se basa en Cap1 para mejorar la estabilidad y la eficiencia traduccional, y reduce el reconocimiento inmunitario innato del ARNm por los receptores tipo Toll (TLR) y otros sensores inmunitarios, minimizando así la activación inmunitaria no deseada. Esto previene respuestas inflamatorias indeseadas, mejorando así la estabilidad y la eficacia del ARNm terapéutico en las células humanas.
| Producto | Tapa AG (3'-OhMe-7mG) | LZCap AG(3'Acm) | AG (sin límite) |
| rendimiento de ARNm (μg) | 164 | 173 | 200 |
Análisis de MS de la eficiencia de recubrimiento del ARNm de la luciferasa LZCapped con un método basado en la ARNasa H. La eficiencia de recubrimiento es de aproximadamente el 97,59 %.
¿Cómo es la estabilidad del ARNm frente a la enzima decapadora?
Los ARNm con LZCap AG(3'Acm) y LZCap AG M6 (3'Acm) muestran mayor resistencia a la enzima decapadora (NEB). Cabe destacar que CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) también es resistente a la enzima decapadora, pero el Cap AG regular (3'-OMe-7mG) no presenta esta resistencia.
¿Cómo es la afinidad de unión de LZCap a eIF4E?
¿Qué tal la expresión proteica del ARNm con capuchón AG(3'Acm) de LZCap?
La expresión del ARNm de la luciferasa con capuchón LZCap AG(3'Acm) es significativamente mayor que la del ARNm con capuchón análogo de Cap1 (3'-OMe-7mG) en diferentes líneas celulares* (3T3-L1, Hela, JAWs, HEK293T y Huh7). El experimento de 130 repeticiones mostró una expresión promedio de aproximadamente 1,5 veces mayor del ARNm de la luciferasa con capuchón LZCap AG(3'Acm) que la del ARNm con capuchón (3'-OMe-7mG). Se observó un resultado similar en ratones. El nivel de expresión de la proteína puede variar ligeramente con diferentes secuencias de ARNm.
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La eficiencia de expresión de LZCap AG(3'Acm) o LZCap AG(3'FMom) capped
El ARNm codificante de GLuc muestra una mayor expresión in vivo en relación con los ARNm con capuchón CapAG (3'-OMe-7mG) en el mono cinomolgo y el cerdo.
¿Qué tal la inmunogenicidad innata de los ARNm con capuchón LZCap AG?
Los ARNm con capuchón LZCapAG (3'Acm) presentan una inmunogenicidad innata baja. TLR8, TLR7, IL-1A y B desempeñan un papel importante en la respuesta inmunitaria inducida por el ARN sin capuchón. Los estudios in vivo del análisis de inmunogenicidad del ARNm LZCapped mostraron que este ARN provocó cambios significativos en el nivel de transcripción de factores inmunitarios en ratones. Tanto los ARNm con capuchón LZCap como los 3'-OMe-7mG muestran un nivel de transcripción de factores inmunitarios similarmente bajo en ratones tras una única inyección estimulada con ARN.
¿Hiciste alguna prueba de seguridad?
Sí, hicimos pruebas de citotoxicidad, estudios de inhibición de la polimerasa humana y pruebas de Ames.
- No se observa citotoxicidad o se observa poca para el monómero nucleósido de 3'-Acm-7mG（CC50＞10000nM） en células 293T, Huh7, MRC5, THP1 y U87MG.
- ADN polimerasa humana ( α ,β , gamma Los estudios de inhibición de la actividad de la ARN polimerasa mitocondrial (hPOLRMT) y de Klenow muestran que 3'-Acm-7mG TP no inhibe la ARN polimerasa humana.
- La prueba de mutación inversa bacteriana (Ames) detecta alteraciones genéticas asociadas, así como carcinógenos genotóxicos en la mayoría de los roedores y humanos. La prueba de Ames demostró que el 3'-Acm-7mG no presenta genotoxicidad.
¿Este producto ha sido patentado?
Sí. La patente ha sido concedida en Estados Unidos.
Información para pedidos
| Nombre del producto | Presupuesto | N° de catálogo |
| LZCap AG(3'Acm)（ 100 mM） | 100 μL, 1 mL | 10684ES |
| LZCap AU(3'Acm)（ 100 mM） | 100 μL, 1 mL | 10685ES |
| LZCap GG(3'Acm)（ 100 mM） | 100 μL, 1 mL | 10686ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy5)（ 25 mM） | 100 μL, 1 mL | 10688ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy7)（ 25 mM） | 100 μL, 1 mL | 10689ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 mM) | 100 μL, 1 mL | 10687ES |
| LZCap (AG(3'Ma-biotina) (25 mM) | 100 μL, 1 mL | Consulta |
| LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 mM) | 100 μL, 1 mL | Consulta |
| LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 mM) | 100 μL, 1 mL | Iconsulta |
| LZCap (AG(3'Acm) ARNm de luciérnaga (1 μg/μL) | 100 μL, 1 mL | Iconsulta |
| LZCap (AG(3'Acm) ARNm de eGFP (1 μg/μL) | 100 μL, 1 mL | Iconsulta |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1 μg/μL) | 100 μL, 1 mL | Iconsulta |
| LZCap (AG(3'Acm) ARNm de RFP (1 μg/μL) | 100 μL, 1 mL | Consulta |
| LZCap (AG(3'Acm) ARNm de Cas9 (1 μg/μL) | 100 μL, 1 mL | Iconsulta |
| LZCap (AG(3'Acm) Gluc ARNm (1 μg/μL) | 100 μL, 1 mL | Iconsulta |
Referencia:
- Mecanismos moleculares de la metilación y el recubrimiento del ARN del coronavirus, Virologica Sinica 31(1)
- Vacunas de ARNm: una nueva era en vaccinología. Rev. Nacional de Drogas. Descubrimiento. 17, 261–279 (2018).
- Iniciación de la traducción regulada por la proteína de unión al ARN en mamíferos: modulación del complejo de iniciación de la traducción por factores que actúan en trans, células 2021, 10(7), 1711
