Kit de síntesis de ARN de alto rendimiento T7 Optimiza el sistema de reacción de transcripción. El kit puede sintetizar el ARN monocatenario de manera eficiente utilizando la ARN polimerasa T7, el ADN bicatenario lineal con la secuencia promotora T7 como plantilla y NTP como sustrato para controlar la secuencia de ADN aguas abajo del promotor. Durante la transcripción, se pueden agregar nucleótidos modificados al sustrato para preparar ARN marcado con biotina o colorante.

1. Introducción del kit de síntesis de ARN de alto rendimiento T7
2. Principios de in vitro transcripción
3. Ventajas del kit de síntesis de ARN de alto rendimiento Yeasen T7
4. Rendimiento del producto
5. Cómo utilizar este kit
6. Preguntas frecuentes
7. Información para pedidos

1. Introducción del kit de síntesis de ARN de alto rendimiento T7

El kit de síntesis de ARN de alto rendimiento T7 puede sintetizar tanto transcripciones largas como cortas, y se pueden producir 100-200 μg de ARN con 1 μg de plantilla de ADN de entrada. El ARN sintetizado se puede utilizar para diversas aplicaciones posteriores, como investigación de la estructura y la función del ARN, protección de ARNasa, hibridación de sondas, interferencia de ARN, microinyección y in vitro traducción.

2. Principios de in vitro transcripción

Figura 1. In vitro proceso de transcripción

3. Ventajas del kit de síntesis de ARN de alto rendimiento Yeasen T7

Rendimientos extremadamente altos: hasta 200 µg en 2 horas
Versátil: adecuado para transcripciones de ARN de entre 20 nt y 10 000 nt
Usos múltiples: genera ARN no marcado, marcado o con tapa

4. Rendimiento del producto

Figura 2. Comparación del rendimiento de IVT

Nota: Todos los reactivos de reacción son de Kit de síntesis de ARN T7 (Yeasen#10623 o empresa B*). Los rendimientos de la reacción IVT de Yeasen y la empresa B* se muestran arriba.

Figura 3. Calidad de los productos transcripcionales para diferentes longitudes.

Figura 4. Nivel de expresión del ARNm transcrito en células HEK-293

Nota: El ARNm está protegido con la enzima Vaccinia (Yeasen#10614/10615)

5. Cómo utilizar este kit

5.1 Reactivos de descongelación

Centrifugue brevemente la mezcla de ARN polimerasa T7 y colóquela en hielo. Descongele el tampón de transcripción 10× y los ribonucleótidos (ATP, CTP, GTP, UTP), mezcle y centrifugue hasta el fondo del tubo, coloque el tampón de transcripción 10× a temperatura ambiente y coloque los cuatro tipos de ribonucleótidos en hielo.

5.2 Prepare el sistema de reacción de transcripción de acuerdo con la siguiente tabla

Tabla 1.Método de preparación del sistema de reacción de transcripción.

Nota:
a) La reacción se prepara a temperatura ambiente. Dado que el tampón de transcripción 10× contiene espermidina, una concentración demasiado alta de espermidina a bajas temperaturas provocará la precipitación de la plantilla de ADN.
b) Transcripción corta (<100 nt), se puede utilizar una plantilla de 2 µg, aumentando el tiempo de transcripción a 4-8 hs.
c) Para transcripciones largas (>1000 nt), se recomienda utilizar plantillas de plásmidos linealizados para la transcripción.
d) Realice la reacción en la máquina PCR con la tapa caliente abierta para evitar que la solución de reacción se evapore durante mucho tiempo.
e) El producto de reacción puede tener un precipitado blanco. Se trata de pirofosfato de magnesio formado por iones de magnesio y pirofosfato libres durante la reacción, que no afectará a los experimentos posteriores. Puedes añadir EDTA para eliminarlo. Si te preocupa que la adición de EDTA afecte a los experimentos posteriores, el sobrenadante también se puede recuperar mediante centrifugación.
f) Los reactivos y recipientes deben estar libres de contaminación por ARNasa.

5.3 Incubar a 37°C durante 2 horas.

Mezclar la solución de reacción anterior, centrifugar brevemente hasta el fondo del tubo e incubar a 37 °C durante 2 h. Si la longitud de transcripción es inferior a 100 nt, aumentar el tiempo de reacción a 4-8 h.

5.4 Tratamiento con DNasa I (opcional)

Una vez completada la reacción, agregue 2 μL de DNasa I (libre de RNasa) a cada tubo e incube a 37 °C durante 15 minutos para eliminar el ADN molde.

6. Preguntas frecuentes

6.1 El rendimiento de la reacción IVT es bajo

La calidad de la plantilla está estrechamente relacionada con el rendimiento. Si el rendimiento del grupo experimental es significativamente menor que el del grupo de control positivo, las posibles razones pueden ser:
① Las plantillas contienen componentes que inhibirán la reacción IVT.
② Hay algún problema con las plantillas.

6.2 Sugerencias

① Vuelva a purificar la plantilla.
② Confirme la concentración e integridad de las plantillas.
③ Prolongar el tiempo de reacción.
④ Aumente la entrada de la plantilla.
⑤Pruebe otras ARN polimerasas y promotores correspondientes.

6.3 El rendimiento de las transcripciones cortas es bajo

Si las transcripciones objetivo son más cortas que 100 nt, extienda el tiempo de reacción a 4-8 horas o aumente la entrada de plantillas a 2 ug en un sistema de reacción de 20 μL.

6.4 Hay transcripciones inesperadamente más largas

Si el resultado de la electroforesis en gel muestra que hay transcripciones inesperadamente más largas, las posibles razones pueden ser:
① Es posible que las plantillas de plásmidos no estén completamente linealizadas.
②Las plantillas tienen extremos cohesivos con voladizos de 3'.
③Las transcripciones tienen una estructura secundaria que no está completamente desnaturalizada.

6.5 Sugerencias

①Verifique que las plantillas de plásmidos estén completamente linealizadas. Si es necesario, vuelva a realizar la linealización del plásmido.
②Seleccione las enzimas de restricción adecuadas para linealizar las plantillas de plásmidos y evitar la producción de extremos cohesivos con salientes 3'. Es posible utilizar el fragmento Klenow o la ADN polimerasa T4 para producir un extremo romo si es necesario.
③Utilice gel desnaturalizado para detectar transcripciones.

6.6 Hay transcripciones inesperadamente más cortas

Si el resultado de la electroforesis en gel muestra que hay transcripciones más cortas inesperadas, las posibles razones pueden ser:
①Existe una secuencia análoga a la secuencia de terminación de la ARN polimerasa T7 en las plantillas.
②El contenido de GC de las plantillas es alto.

6.7 Sugerencias

①Disminuya la temperatura de reacción (por ejemplo, 30 ℃), pero tenga en cuenta que a veces disminuir la temperatura de reacción reducirá los rendimientos.
②Pruebe otras ARN polimerasas para catalizar la reacción IVT.
③Si el contenido de GC de las plantillas es alto, configure la temperatura de reacción IVT a 42 ℃ o agregue SSB al sistema de reacción IVT para aumentar los rendimientos y la longitud de las transcripciones.

6.8 Hay manchas de transcripciones durante la electroforesis en gel.

Si se produce una mancha en las transcripciones durante la electroforesis en gel, las posibles razones pueden ser:
①Hay contaminación por ARNasa durante la operación experimental.
②Las plantillas de ADN están contaminadas por ARNasas.

6.9 Sugerencias

① Asegúrese de que todos los reactivos estén formulados con H2O libre de ARNasa. Utilice puntas de pipeta y tubos Eppendorf libres de ARNasa y use guantes y mascarillas de látex desechables durante el trabajo experimental.
②Vuelva a purificar las plantillas de ADN.

7. Información para pedidos

Los siguientes son productos representativos que ofrece Yeasen. Hay tamaños adicionales disponibles. Nuestros productos están altamente optimizados para funcionar en conjunto, a fin de garantizar un rendimiento y una reproducibilidad superiores.
También podemos ofrecer servicios personalizados. Si está interesado en un producto que no se muestra, contáctenos y trabajaremos con usted para satisfacer sus necesidades.

Tabla 2.Información del producto

Respecto a la lectura:

Reactivos de grado GMP para la síntesis in vitro de ARNm

Materias primas para síntesis in vitro de ARNm de grado GMP de Yeasen Biotechnology