Un logro revolucionario de Yeasen y biotecnología Molefuture

Con el rápido desarrollo de la biotecnología, la terapia con ARNm, como método de tratamiento emergente, ha atraído mucha atención debido a su gran capacidad de programación y rápida velocidad de respuesta. En campos como las vacunas de ARNm y la terapia génica, la síntesis eficiente de ARNm de alta calidad es un paso crucial para lograr los objetivos terapéuticos. En este proceso, la ARN polimerasa T7 desempeña un papel crucial, ya que puede catalizar eficientemente la síntesis in vitro de ARNm.

El problema del subproducto dsRNA de la ARN polimerasa T7

Aunque la ARN polimerasa T7 desempeña un papel importante en la síntesis de ARNm, la operación en sí suele dar como resultado la producción de ARN bicatenario (ARNbc) como subproducto. La presencia de ARNbc no solo reduce el rendimiento y la pureza del ARNm, sino que también puede desencadenar respuestas inmunitarias no específicas, lo que afecta la eficacia y la seguridad. Por lo tanto, reducir la producción de ARNbc se ha convertido en una necesidad urgente en la industria. En la actualidad, los métodos para reducir el ARN bicatenario incluyen principalmente la optimización de las condiciones de reacción y el uso de enzimas auxiliares. Si bien estos métodos pueden reducir la producción de ARN bicatenario hasta cierto punto, suelen conllevar problemas como una operación compleja y mayores costos.

¿Por qué deberíamos realizar ingeniería de la ARN polimerasa T7?

La modificación directa de la ARN polimerasa T7 para reducir la producción de ARN bicatenario es una solución más fundamental. Las técnicas de evolución dirigida por enzimas pueden mejorar sus propiedades catalíticas y aumentar la pureza y el rendimiento de los productos modificando con precisión la secuencia o la estructura de aminoácidos de la enzima. En el caso de la ARN polimerasa T7, la modificación dirigida no solo puede reducir la producción de ARN bicatenario, sino que también mejora la eficiencia y la calidad generales de la síntesis de ARN mensajero.

Como proveedor de materias primas para la síntesis in vitro de ARNm, Yeasen Biotecnología, y Su filial Molefuture Biotecnología, tener Se desarrolló una nueva ARN polimerasa T7 utilizando la plataforma de evolución dirigida ZymeEditor. Para minimizar la producción de subproductos como el ARN de doble cadena durante los procesos de transcripción in vitro, el equipo de evolución diseñó la ARN polimerasa T7 mediante una combinación de diseño racional y selección dirigida.

¿Cómo se genera el dsRNA?

Según los informes de la literatura, la producción del subproducto dsRNA se origina principalmente de dos fuentes (Figura 1): La primera es durante la transición de la ARN polimerasa T7 de la conformación de iniciación a la conformación de elongación en las primeras etapas de la transcripción, el complejo ternario de transcripción es propenso a la disociación [1], lo que resulta en la liberación de una gran cantidad de cadenas cortas de ARN (ARN abortivo) con longitudes de alrededor de 20 nt en el sistema. Estas cadenas de ARN actúan como "cebadores", apareándose complementariamente con cadenas largas de ARN, y se extienden para producir dsRNA bajo la acción de la actividad de ARN polimerasa dependiente de ARN de la ARN polimerasa T7 (actividad RDRP) [2,3]. La segunda fuente es desencadenada por la actividad de transferencia de ribonucleótido terminal que posee la ARN polimerasa T7. Cuando la reacción de transcripción alcanza el final de la plantilla lineal, la ARN polimerasa T7 puede agregar aleatoriamente varios ribonucleótidos sin dependencia de la plantilla. Estos ribonucleótidos, que forman "cebadores aleatorios", pueden plegarse de forma inversa y emparejarse de forma complementaria con la región de ARNm diana, extendiéndose para producir ARNbc. El ARNbc producido mediante la formación de bucles se denomina ARNbc de bucle invertido [3,4]. Por lo tanto, para reducir los subproductos del ARNbc, el objetivo de la modificación de la ARN polimerasa T7 radica en estabilizar el complejo ternario de transcripción temprana o debilitar la actividad de transferencia terminal y la ARN polimerasa dependiente de ARN (RDRP). actividad de la ARN polimerasa T7.

Figura 1. Diagrama esquemático de la barrera energética y del principio de formación del ARN bicatenario (datos no publicados)

Cómo superarlo barrera energética de la ARN polimerasa T7 transición conformacional?

A través del análisis estructural y de energía libre, el equipo, por un lado, descubrió que junto con los cambios conformacionales de la ARN polimerasa T7, también hay un cambio en la energía. La energía libre de la conformación de elongación es significativamente mayor que la de la conformación de iniciación, lo que indica que el proceso de transcripción necesita superar una barrera de energía más alta para producir cadenas de ARNm completas. Una barrera de energía alta es desfavorable para una transición conformacional fluida. Por lo tanto, el equipo utilizó racional métodos de detección para identificar más de 20 aminoácidos de punto caliente y construir bibliotecas de mutagénesis de saturación correspondientes.

Cómo modificar el Transferencia terminal y actividades RDRP de la ARN polimerasa T7

Por otra parte, considerando los informes limitados sobre las funciones, sitios y dominios estructurales relacionados con la transferencia terminal y las actividades RDRP de la ARN polimerasa T7, y debido a que estas dos actividades, que son funcionalmente similares, probablemente comparten sitios clave con la reacción principal de la ARN polimerasa T7 (la actividad de transcripción, es decir, la actividad de polimerización de ARN dependiente de ADN, DDRP) es difícil encontrar aminoácidos de punto caliente para la modificación dirigida al sitio. Por lo tanto, el equipo construyó simultáneamente varias bibliotecas de mutación aleatoria basadas en PCR propensa a errores, combinadas con la capacidad de evolución de alto rendimiento de la plataforma ZymeEditor, lo que resultó en una diversidad que supera los 10^6 para cada biblioteca individual.

Descubrimiento del ideal basado en sondas ARN polimerasa T7

Para equilibrar la producción de la ARN polimerasa T7 y monitorear el contenido de dsRNA en la reacción de transcripción in vitro, el equipo, con referencia a plantillas de transcripción optimizadas, diseñó cuidadosamente múltiples fluorescencias. sondas dirigidas a diferentes regiones de los productos de ARNm objetivo. Estas sondas asocian información como el rendimiento de la reacción, la integridad y el contenido de dsRNA dentro del sistema con señales de fluorescencia. Cuanto más fuerte sea la intensidad de fluorescencia del sistema, más ventajoso será el rendimiento del mutante. En teoría, este método de selección puede clasificar mutantes en función de la intensidad de fluorescencia de diferentes sondas, obteniendo mutantes de la ARN polimerasa T7 con alto rendimiento o ARN abortivo reducido, así como mutantes con integridad mejorada o dsRNA de bucle reducido. Cuando la plantilla de reacción se reemplaza con ARN, los mutantes con actividad RDRP reducida también pueden ser seleccionados negativamente, mejorando la selectividad de la plantilla de la ARN polimerasa T7. Además, al agregar nucleótidos modificados, análogos de capuchón y aumentar la temperatura de reacción en el sistema de reacción de gotitas, se puede realizar una selección adicional para seleccionar mutantes de la ARN polimerasa T7 que toleran sustratos no naturales y exhiben una estabilidad térmica mejorada.

Cómo realizar la mejor selección ARN polimerasa T7?

En función del tamaño de las bibliotecas, el equipo Se desarrollaron procesos de cribado de ultra alto rendimiento basados ​​en la clasificación de gotas activadas por fluorescencia (FADS) y procesos de cribado de alto rendimiento basados ​​en métodos tradicionales de microplacas (MTPS).A través de múltiples rondas de experimentos, se examinaron más de 10^7 mutantes en total, lo que dio como resultado múltiples mutantes con un contenido de dsRNA significativamente reducido. Entre ellos, algunos mutantes mostraron una disminución en el dsRNA causada por el ARN abortivo en la reacción, lo que sugiere que la conformación de elongación de estos mutantes de polimerasa es más estable. Algunos mutantes mostraron una disminución en el contenido de dsRNA de bucle invertido en la reacción, lo que indica un debilitamiento de la actividad de transferencia terminal o la actividad RDRP en estos mutantes.

Dado que las ventajas de rendimiento de los mutantes mencionados anteriormente se derivan de mecanismos diferentes, el equipo Ha construido bibliotecas de mezcla de ADN dirigidas a ellos. Después de la selección, el equipo Finalmente se obtuvieron mutantes de rendimiento superior con una generación extremadamente baja de dsRNA sin afectar los rendimientos ni la integridad del mRNA (Figura 2). Sin embargo, los rendimientos de un mutante G47A+884G descubierto por Moderna se vieron afectados^[5] (inédito).

Figura 2. Proceso de evolución de la enzima y caracterización del rendimiento de los mutantes.

(inédito)

Análisis de la generación de dsRNA por ARN polimerasa T7 ¿Variantes?

Después del análisis cuantitativo, como se muestra en la Figura 3, utilizando una plantilla de transcripción de 9 kb en condiciones de protección de co-transcripción, la ARN polimerasa T7 de tipo salvaje produjo aproximadamente 2,9 ng/μg de dsRNA cuando se usaron nucleótidos naturales, mientras que una Enzima T7 produjo aproximadamente 0,18 ng/μg de dsRNA. Sin embargo, la producción de dsRNA de cada variante de la ARN polimerasa T7 construido fue inferior a 0,10 ng/μg. En particular, uno variante fue sólo 0,015 ng/μg, casi 200 veces menor que el tipo salvaje y 12 veces menor que el comercial producto. Después de pruebas repetidas, la ventaja de rendimiento de las variantes en la reducción de dsRNA se observó de manera consistente en diferentes condiciones de reacción, lo que indica una buena compatibilidad del sistema de estos mutantes y sienta las bases para reducir aún más la producción de dsRNA a través del tampón de reacción. Optimización. Además, el análisis FADS también obtuvo múltiples variantes con una mejor integridad del producto y estabilidad térmica, que pueden cumplir con los requisitos de una gama más amplia de aplicaciones de transcripción in vitro.

Figura 3. Evaluación de la generación de dsRNA por variantes de la ARN polimerasa T7 evaluadas utilizando el kit ELISA de ARN bicatenario (dsRNA) de Yeasen y el análisis de transferencia de puntos de anticuerpos J2.

Actualmente, varios socios ya han probado las variantes de la ARN polimerasa T7 y hemos recibido grandes elogios de ellos. El uso de la nueva enzima simplifica el proceso de purificación de ARNm, mejora la eficiencia del trabajo y demuestra un rendimiento excepcional en múltiples escenarios de aplicación.

Estas variantes se encuentran en solicitudes de patente y agradecemos las conversaciones para la cooperación y el licenciamiento de tecnologías.

Acerca de Molefuture Biotechnology

Molefuture Biotechnology es una subsidiaria de Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., especializada en brindar soluciones de modificación de enzimas personalizadas impulsadas por la tecnología de evolución de enzimas.Aprovechar los recursos de Yeasen Biotecnología, Molefuture opera en seis plataformas tecnológicas principales: la innovadora plataforma de evolución de enzimas ZymeEditor, una plataforma de expresión de alta eficiencia en múltiples hospedadores, una plataforma de desarrollo de procesos de fermentación, una plataforma de desarrollo de procesos de purificación, una plataforma de producción de enzimas ultralimpias y una plataforma de análisis y control de calidad de enzimas. Con estas seis plataformas tecnológicas, Molefuture puede ofrecer un conjunto completo de soluciones personalizadas que incluyen evolución dirigida por enzimas, desarrollo de nuevas enzimas, desarrollo de procesos enzimáticos y producción a gran escala a nivel de GMP para satisfacer las demandas de aplicación de enzimas en áreas como diagnóstico in vitro, biomedicina, biología sintética, estética médica, intermediarios farmacéuticos, etc.

Información de pedidos

Los siguientes son productos representativos ofrecidos por Yeasen. Hay tamaños adicionales disponibles. Nuestros productos están altamente optimizados para funcionar en conjunto, para ayudar a garantizar un rendimiento y una reproducibilidad superiores. También podemos proporcionar servicios personalizados. Si está interesado en un producto que no se muestra, comuníquese con nosotros y trabajaremos con usted para satisfacer sus necesidades.

Respecto a la lectura:

Compartiendo el informe de validación del kit ELISA de ARN bicatenario (dsRNA) para promover la estandarización de la detección de dsRNA.

Referencias:

[1] Sousa R, Mukherjee S. T7 RNA polymerase[J]. Progreso en la investigación de ácidos nucleicos y biología molecular, 2003: 1-41.

[2] Steitz T A. Los cambios estructurales de la ARN polimerasa T7 desde el inicio de la transcripción hasta la elongación [J]. Opinión actual en biología estructural, 2009, 19(6): 683-690.

[3] Vallejo D, Nikoomanzar A, Paegel BM, et al. Clasificación de gotas activada por fluorescencia para la evolución dirigida a células individuales[J]. ACS Synthetic Biology, 2019, 8(6): 1430-1440.

[4] Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin C T. Las adiciones del extremo 3′ por la ARN polimerasa T7 son ARN autopropulsado, distributivo y de carácter diverso: análisis de ARN-Seq [J]. Investigación de ácidos nucleicos, 2018, 46(18): 9253-9263.

[5] Dousis A, Ravichandran K, Hobert EM, et al. Una ARN polimerasa T7 diseñada que produce ARNm libre de subproductos inmunoestimulantes[J]. Nature Biotechnology, 2023, 41(4): 560-568.