¿Está buscando una forma confiable de detectar ARN de doble cadena residual durante la transcripción in vitro de ARNm? No busque más que el kit ELISA de ARN bicatenario (ARNbc). Sin embargo, con varios kits comerciales disponibles, es importante tener en cuenta que los datos de validación pueden no estar siempre disponibles públicamente, lo que genera inconsistencias en la detección de ARN de doble cadena. Es por eso que compartimos nuestro informe de validación del kit ELISA de ARN de doble cadena (ARNbc), que cubre la especificidad, precisión, exactitud, sensibilidad y durabilidad. Este informe sirve como guía de referencia para validar métodos de detección de residuos de ARN de doble cadena adaptados a condiciones experimentales específicas y estándares farmacopeicos regulatorios. Obtenga más información sobre nuestro informe de validación Promover la estandarización de la detección de dsRNA.
ELISA de ARN bicatenario (dsRNA) Kél
Fondo:
El kit ELISA de ARN bicatenario (dsRNA) es un kit de reactivos diseñado para detectar el dsRNA residual producido durante el proceso de transcripción in vitro del ARNm. Este kit, que emplea el principio experimental del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de tipo sándwich de doble anticuerpo y el sistema de amplificación con biotina-estreptavidina, ofrece una detección sensible del dsRNA residual en muestras.
Los datos resumidos contienen parámetros de validación que abarcan la especificidad, precisión, exactitud, sensibilidad y durabilidad. El informe actúa como una guía de referencia que insta a los usuarios a validar los métodos de detección de residuos de ARN de doble cadena adaptados a sus condiciones experimentales específicas y que cumplan con los estándares de la farmacopea regulatoria.
Materiales y métodos:
Equipo: Kit ELISA de ARN bicatenario (dsRNA): Cat#36717ES (YEASEN)El kit incluye cuatro tipos distintos de muestras estándar de ARN de doble cadena. Los usuarios tienen la opción de elegir el tipo de muestra estándar que se ajuste a su proceso específico para generar la curva estándar, evitando así la necesidad de preparar y analizar todas las muestras.
Métodos: Los materiales y los pasos de procedimiento esenciales para el experimento están especificados predominantemente por Yeasen Biotechnology. El kit ha sido sometido a pruebas y evaluaciones exhaustivas, lo que garantiza que su rendimiento cumple con los requisitos estipulados en ICH Q2(R1) y la edición 2020 de la Parte Cuatro de la Farmacopea China "9101 Pautas de validación de métodos analíticos".
Resultados
- Linealidad de los estándares de dsRNA
En este informe se han desarrollado curvas estándar para los cuatro tipos distintos de estándares de dsRNA, cada uno con una longitud de 300 pb. Estos estándares incluyen STD1, dsRNA sin modificar; STD2, dsRNA modificado con pseudo-UTP; STD3, dsRNA modificado con N1-Me-Pseudo-UTP; y STD4, dsRNA modificado con 5-OMe-UTP. Cada tipo de estándar de dsRNA muestra una excelente linealidad de dilución con R2 > 0,99 y un coeficiente de variación (CV) de concentración medida inferior al 10 %, como se muestra en las Tablas 1 a 5.
| Nombre de la ETS | Tipo UTP | Linealidad de la dilución (R2＞0,99) | CV |
| ETS1 | Unión Soviética | 0.0156-1 pg/μL | ＜10% |
| ETS2 | PUTP | 0,0156-1 pg/μL | ＜10% |
| ETS3 | N1-Me-pUTP | 0,0312-1 pg/μL | ＜10% |
| ETS4 | 5-OMe-UTP | 0,0625-1 pg/μL | ＜10% |
Tabla 1. Linealidad de diferentes estándares de dsRNA.
| Concentración STD1norte. (pg/μL) | Media medida (pg/μL) | Recuperación | CV |
| 1 | 1.0001 | 100.0% | 3,1% |
| 0,5 | 0,4994 | 99,9% | 2,4% |
| 0,25 | 0,2516 | 100,7% | 3,3% |
| 0,125 | 0,1227 | 98,1% | 0,5% |
| 0,0625 | 0,0640 | 102,5% | 3,2% |
| 0,0312 | 0,0309 | 99,2% | 1,3% |
| 0,0156 | 0,0157 | 100,4% | 3,2% |
| 0 | / | / | / |
Tabla 2.La recuperación y el CV de STD1 diluido
| Concentración STD2norte. (pg/μL) | Media medida (pg/μL) | Recuperación | CV |
| 1 | 1.0001 | 100.0% | 0,7% |
| 0,5 | 0,4994 | 99,9% | 0,1% |
| 0,25 | 0,2514 | 100,6% | 0,9% |
| 0,125 | 0,1232 | 98,6% | 2,5% |
| 0,0625 | 0,0635 | 101,6% | 1,1% |
| 0,0312 | 0,0312 | 99,9% | 0,5% |
| 0,0156 | 0,0155 | 99,6% | 0,0% |
| 0 | / | / | / |
Tabla 3. La recuperación y el CV de STD2 diluido
| Concentración STD3 (pg/μL) | Media medida (pg/μL) | Recuperación | CV |
| 2 | 2.0031 | 100,2% | 1.6% |
| 1 | 0,9880 | 98,8% | 2,4% |
| 0,5 | 0,5188 | 103,8% | 1,2% |
| 0,25 | 0,2383 | 95,3% | 2,2% |
| 0,125 | 0,1242 | 99,4% | 0,1% |
| 0,0625 | 0,0629 | 100,7% | 1,8% |
| 0,0312 | 0,0361 | 115,7% | 1,6% |
| 0 | / | / | / |
Tabla 4. La recuperación y el CV de STD3 diluido
| Concentración STD4 (pg/μL) | Media medida (pg/μL) | Recuperación | CV |
| 4 | 4.0096 | 100,2% | 1,9% |
| 2 | 1.9940 | 99,7% | 0,7% |
| 1 | 0,9977 | 99,8% | 0,1% |
| 0,5 | 0,5108 | 102.2% | 0,1% |
| 0,25 | 0,2454 | 98,2% | 5,6% |
| 0,125 | 0,1207 | 96,5% | 2,8% |
| 0,0625 | 0,0624 | 99,9% | 0,3% |
| 0 | / | / | / |
Tabla 5. La recuperación y el CV de STD4 diluido
-
Especificidad
- Análisis de especificidad con dsRNA, ssRNA, dsDNA y ssDNA.
- La especificidad no se vio afectada por la longitud de los dsRNA.
-
APrecisión
Añadiendo 0,5 pg/μL de STD1 Se realizó una prueba de amplificación de una muestra de ARNm conocida con un contenido de ARNbc de 0,36 pg/μL en tres proporciones de volumen diferentes (1:1, 1:20, 1:250). En todos los casos, las tasas de recuperación de la proteína pico se situaron en el rango del 80-120%.
La tasa de recuperación de picos se calcula de la siguiente manera: Pico Recuperación Tasa=(Medida concentración después picos×Total volumen de claveteado muestra-medida concentración de el muestra×Total volumen de el muestra)/(Teórico concentración de el pico×volumen de el pico)×100%
| Muestras | Relación de volumen de STD1/muestra | dsRNA medido (pg/μL) | Espiga Recuperación Tasa |
| Muestra (TS) | / | 0,36 | / |
| TS+0,5 pg/μL ETS1 | 1:1 | 0,769 | 81% |
| TS+0,5 pg/μL ETS1 | 1:20 | 0,777 | 82% |
| TS+0,5 pg/μL ETS1 | 1:250 | 0.803 | 82% |
Tabla 6. Tasa de recuperación de picos análisis
-
Precisión
- Precisión intraensayo
Se realizaron experimentos en tres niveles de concentración (alto, medio y bajo) para cada una de las cuatro muestras estándar de ARNbc. En un solo experimento, cada muestra de concentración se sometió a ocho pruebas repetidas. Los resultados muestran que el coeficiente de variación (CV) es inferior al 15 %. lo que indica una buena precisión intraensayo.
| ETS1 | |||
| Teorético concentración (pg/μL) | Se replica | Media medida (pg/μL) | CV |
| 1 | 8 | 1.0002 | 3,11% |
| 0,125 | 8 | 0,1230 | 0,46% |
| 0,0156 | 8 | 0,0164 | 3,18% |
| Enfermedad de transmisión sexual tipo 2 | |||
| Teorético concentración (pg/μL) | Se replica | Media medida (pg/μL) | CV |
| 1 | 8 | 1.0001 | 0,65% |
| 0,125 | 8 | 0,1231 | 2,46% |
| 0,0156 | 8 | 0,0162 | 0,02% |
| ETS3 | |||
| Teorético concentración (pg/μL) | Se replica | Media medida (pg/μL) | CV |
| 2 | 8 | 2.0022 | 1,58% |
| 0,25 | 8 | 0,2444 | 2,17% |
| 0,0312 | 8 | 0,0328 | 1,64% |
| ETS4 | |||
| Teorético concentración (pg/μL) | Se replica | Media medida (pg/μL) | CV |
| 8 | 8 | 8.0803 | 0,27% |
| 1 | 8 | 0,9650 | 0,12% |
| 0,125 | 8 | 0,1322 | 2.76% |
Tabla 7. Análisis de precisión intraensayo
- Precisión entre ensayos
Se realizaron tres experimentos utilizando kits de 3 En cada experimento, se eligieron concentraciones altas, medias y bajas y se analizaron tres veces para cada una de las cuatro muestras estándar de dsRNA, con ocho réplicas. En consecuencia, se adquirieron 24 puntos de datos en cada nivel de concentración, que luego se utilizó para el análisis del coeficiente de variación (CV). Los resultados muestran que el CV para cada concentración de los estándares fue inferior al 15%.
| ETS1 | |||
| Teorético concentración (pg/μL) | Pruebas independientes/réplicas | Media medida (pg/μL) | CV |
| 1 | 3/8 | 1.0007 | 2,38% |
| 0,125 | 3/8 | 0,1186 | 3,20% |
| 0,0156 | 3/8 | 0,0173 | 1,27% |
| ETS2 | |||
| Teorético concentración (pg/μL) | Pruebas independientes/réplicas | Media medida (pg/μL) | CV |
| 1 | 3/8 | 0,9987 | 0,09% |
| 0,125 | 3/8 | 0,1269 | 1,06% |
| 0,0156 | 3/8 | 0,0151 | 0,52% |
| ETS3 | |||
| Teorético concentración (pg/μL) | Pruebas independientes/réplicas | Media medida (pg/μL) | CV |
| 2 | 3/8 | 2.0012 | 2,37% |
| 0,25 | 3/8 | 0,2415 | 0,14% |
| 0,0312 | 3/8 | 0,0330 | 1,81% |
| ETS4 | |||
| Teorético concentración (pg/μL) | Pruebas independientes/réplicas | Media medida (pg/μL) | CV |
| 8 | 3/8 | 7.9735 | 1,89% |
| 1 | 3/8 | 1.0225 | 0,13% |
| 0,125 | 3/8 | 0.1227 | 5,63% |
Tabla 8. Análisis de precisión entre ensayos
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Sensibilidad
- Nivel de detalle
El límite de detección de la equipo Se determina sumando el doble de la desviación estándar a la media de los valores en blanco. Al medir la DO de 24 blancos, calcular su media y desviación estándar y luego aplicar estos valores a la curva ajustada, se obtiene el límite de detección correspondiente. se obtiene.
|
| sobredosis |
| ||
| ARNbc Estándar | Media de espacio en blanco | DAKOTA DEL SUR de blanco | Media de blanco + 2 DE | Nivel de detalle |
| ETS1 | 0,016 | 0,00048 | 0,01696 | ≤0,001 pg/μL |
| ETS2 | 0,016 | 0,00072 | 0,01744 | ≤0,001 pg/μL |
| ETS3 | 0,034 | 0,00119 | 0,03638 | ≤0,001 pg/μL |
| ETS4 | 0,115 | 0,00290 | 0,1208 | ≤0,01 pg/μL |
Tabla 9. Análisis LOD
- Límite de cuantificación
El límite cuantitativo de la equipo se establece diluyendo el punto de concentración más bajo de la curva estándar a niveles aún más bajos, asegurando un CV < 20% en la concentración más baja, definiendo así el umbral cuantitativo. El LOQ es el siguiente.
| ARNbc Estándar | Límite de cuantificación | Se replica | CV(%) | Recuperación (%) |
| ETS1 | 0,0156 pg/μL | 24 | ＜10% | 80 ~ 120 % |
| ETS2 | 0,0312 pg/μL | 24 | ＜10% | 80 ~ 120 % |
| ETS3 | 0,0156 pg/μL | 24 | ＜10% | 80 ~ 120 % |
| ETS4 | 0,125 pg/μL | 24 | ＜10% | 80 ~ 120 % |
-
Durabilidad
- Antiinterferencias en materiales IVT
Esta prueba El objetivo fue evaluar el impacto de varias enzimas, tampones, etc., añadidos al ARNm muestra sobre la detección de dsRNA mediante el kit.
Agregar concentraciones específicas de ARN polimerasa T7, inhibidor de ARNasa, IPPA (pirofosfatasa inorgánica), ADNasa I, VCE (enzima de protección de la vacuna), 2'-O-metiltransferasa (MT), tampón 1×IVT y citrato de sodio 1 mM a una muestra de ARNm proporcionada y, posteriormente, utilizar STD3 Tanto para la preparación de la curva estándar como para la prueba de muestras, permitió evaluar la capacidad del kit para detectar el contenido de dsRNA en estos Muestras. Los resultados demuestran que la presencia de ocho enzimas y tampones diferentes no afectó la detección precisa de dsRNA. Además, las tasas de recuperación observadas estuvieron dentro del rango del 80% al 120%.
| Materiales de TVI | ARNbc Medido (pg/μL) | Recuperación |
| Ninguno | 0,6057 | 100% |
| ARN polimerasa T7 (15 μg/ml) | 0,5411 | 89,32% |
| Inhibidor de la ARNasa murina (27,5 μg/ml) | 0,5142 | 84,88% |
| Pirofosfatasa inorgánica (IPPA 10 μg/mL) | 0,7132 | 117,7% |
| DNasa I (13,75 μg/ml) | 0,6077 | 100,32% |
| Enzima de operculación de vaccinia (10 μg/mL) | 0,6563 | 108,3% |
| 2´-O-Metiltransferasa (10 μg/mL) | 0,5776 | 95,4% |
| 1 × tampón IVT | 0,5003 | 82,6% |
| 1 milimolargo Citrato de sodio | 0,6251 | 103,2% |
Tabla 11. Recuperación de STD3 diluido añadido con materiales IVT
- Temperatura durabilidad
Los kits se almacenaron en ambos 4°C y 37°C para detectar las variaciones de concentración del ARN de doble cadena estándar después de 7 días. Los resultados muestran que todas las variaciones están dentro del 20 %.
| ARNbc Estándar | ARNbc Medido (pg/μL) Día 0 | Las variaciones Después de 7 días a 4°C |
| ETS1 | 1 | 10% |
| Enfermedad de transmisión sexual tipo 2 | 1 | 5% |
| ETS3 | 2 | 7% |
| ETS4 | 4 | 11% |
| ARNbc Estándar | ARNbc Medido (pg/μL) | Las variaciones Después de 7 días a 37°C |
| ETS1 | 1 | 18% |
| ETS2 | 1 | 4% |
| ETS3 | 2 | 5% |
| ETS4 | 4 | 8% |
Tabla 12. Análisis de durabilidad a la temperatura
Producto relacionado:
| Nombre del producto | Código SKU | Presupuesto |
| Kit ELISA de ARN bicatenario (dsRNA) | 36717ES | 48 dientes/96 dientes |
| ARN polimerasa T7 CleaScrip™ (ARN de cadena corta bajo, 250 U/μL) | 10628ES | 10/100 ku |
| ARN polimerasa T7 Grado GMP (250 U/μL) | 10625ES | 10/100 ku |
Lectura relacionada:
Se utilizó el kit ELISA de ARN bicatenario (dsRNA) para validar mutantes de la ARN polimerasa T7 con bajo contenido de dsRNA, junto con el método de transferencia de puntos de anticuerpos J2.
Referencias:
- ICH, 2022: Validación de métodos analíticos Q2, versión borrador.
- NMPA, 2007: Principios generales para la evaluación de la validación de métodos analíticos para el análisis de control de calidad de productos biológicos
- Comisión de la Farmacopea China (ChPC), 2020: Farmacopea china, cuarta parte: Directrices para la validación de métodos de análisis cuantitativo para muestras biológicas