En los últimos años, los medicamentos basados en ARNm han ganado mucha atención y han atraído el foco de investigación. La ARN polimerasa T7 es conocida por su simplicidad y capacidad para catalizar la síntesis de ARN con alto rendimiento y fidelidad in vitro. Sin embargo, durante el proceso de transcripción, la ARN polimerasa T7 puede producir subproductos como ARN cortos abortados, ARN terminados prematuramente y ARN extendidos en 3', lo que crea condiciones favorables para la formación de ARN de doble cadena. Por lo tanto, reducir la producción de ARN de doble cadena se ha convertido en una necesidad urgente en aplicaciones prácticas.
Recientemente, se publicó un estudio innovador titulado "El diseño semirracional y FADS modificó la ARN polimerasa T7 y redujo la producción de dsRNA, con menores actividades de transferasa terminal y RDRP" fue publicado en línea por Yeasen y el equipo de Molefuture. Los investigadores diseñaron con éxito la ARN polimerasa T7 para reducir significativamente la producción de subproductos de ARN bicatenario durante la transcripción, reduciéndola al 1,8 % de la enzima de tipo salvaje mediante una combinación de evolución dirigida y diseño semirracional.
Detección de ARN polimerasa T7 basada en FADS
Para la detección de la ARN polimerasa T7, se eligió FADS (clasificación de gotas activada por fluorescencia) para cumplir con los requisitos de alto rendimiento de la evolución de las proteínas. Para evitar la fragmentación prematura de las células, los investigadores utilizaron un chip PDMS con fases acuosas duales, donde la lisozima se mezcló con las células en el chip y ejerció su actividad dentro de las gotas. Figura 1Los investigadores generaron varias bibliotecas de mutantes aleatorios con una diversidad que va desde 105 hasta 106Después de la selección, se identificaron 10 variantes dominantes y se designaron como Mut1 a Mut10. Como se muestra en Figura 2E y Figura 2F, el contenido de dsRNA de Mut1, Mut7 y Mut9 fue significativamente menor que el del tipo salvaje
Figura 1. Descripción general del FADS
Figura 2. Selección aleatoria de bibliotecas y evaluación de variantes
Diseño semirracional de la ARN polimerasa T7
Investigadores Realizó una exploración de diseño semirracional, creó diez bibliotecas saturadas de un solo sitio y empleó el método tradicional de sondas duales basado en placa de microtitulación para la detección.Figura 3). La sonda del extremo 5' agregada se utiliza para la detección del rendimiento de ARN.
Figura 3. Diseño semirracional guiado por la estructura para ARNbc disminuido
Después de examinar más de 1000 mutantes, los investigadores Se identificaron seis candidatos: Mut11 (K180E), Mut12 (S228F), Mut13 (G238L), Mut14 (A70Q), Mut15 (A383H) y Mut16 (I743L). El rendimiento total de ARN de los seis mutantes no difirió significativamente del tipo salvaje, lo que indica una eficiencia de transcripción general comparable. Como era de esperar, el contenido de ARN bicatenario de Mut11 y Mut14 fue significativamente menor en comparación con el tipo salvaje.Figura 4).
Figura 4. Cribado de microplacas y evaluación de variantes
Mut17 de la mezcla de ADN produce menos dsRNA
Para optimizar aún más la ARN polimerasa T7, se seleccionaron cuatro variantes con bajo contenido de ARNdc que cumplieran con los requisitos de producción.Los investigadores construyeron una biblioteca de reordenamiento de ADN y, tras analizarla con placas de microtitulación, identificaron una variante que exhibía una menor producción de dsRNA en comparación con su ARN polimerasa T7 parental, denominada Mut17 (A70Q/F162S/K180E). Posteriormente, analizaron los productos transcripcionales de Mut17 y sus variantes parentales (Mut14, Mut11 y Mut7). Como se muestra en Figura 5Las cuatro variantes mostraron reducciones significativas en la producción de dsRNA durante la transcripción en comparación con el tipo salvaje. Sorprendentemente, Mut17 mostró un contenido de dsRNA significativamente menor de solo 1,80 % y tan bajo como 0,007 ng/μg en el sistema de solvente de detección.
Figura 5. Contenido de dsRNA de Mut17 y sus mutaciones parentales
La inmunogenicidad del producto IVT del mutante es significativamente menor que la del tipo salvaje.
Próximo, Evaluamos la inmunogenicidad de los productos IVT en AR murinaW264.7 células. Como se muestra en las Figuras 2A y 2B, los niveles de ARNm y proteína de IFN-β se redujeron en ARW264.7 células transfectadas con ARNm producido por mutantes en comparación con el tipo salvaje, lo que indica que el ARNm sintetizado por la ARN polimerasa T7 de tipo salvaje provocó la respuesta inmune más fuerte, mientras que el ARNm de los mutantes mostró una respuesta significativamente reducida. En concreto, el ARNm de IFN-β de las células tratadas con ARN Mut11 fue solo el 9,7% del de las células tratadas con el tipo salvaje, y su proteína fue de 12,93 pg/mL. Además, la expresión de EGFP no mostró diferencias significativas en cantidad o calidad entre los ARNm generados por diferentes ARN polimerasas T7. (Figura 6C), cumpliendo los requisitos para aplicaciones industriales.
Figura 6. Respuesta de IFN-β y expresión de EGFP en células de mamíferos
Las actividades de RDRP y transferasa terminal del mutante son mucho más bajas.nosotrosr que los del tipo salvaje.
Para investigar el impacto de las mutaciones en la reducción del ARNbc, los investigadores Se realizaron estudios in silico sobre todas estas mutaciones. El resultado sugiere una clara indicación de una actividad reducida de RDRP en las variantes, ya que muestran una menor tendencia a utilizar el ARN como plantilla. De manera similar, esto puede haber tenido un impacto en la actividad de la transferasa terminal de la ARN polimerasa T7. Como se muestra en Cifra 7Bajo diferentes concentraciones, las 4 variantes exhibieron menos del 50% del valor de fluorescencia en comparación con el tipo salvaje.
Posteriormente, se empleó un ensayo de heterogeneidad del extremo 3' para caracterizar la actividad de transferencia terminal de la ARN polimerasa T7. Al centrarse en la proporción de ARN con n>0, que refleja la actividad de la transferasa terminal, los investigadores Se encontró que estos ARN representaban el 82,94% en el tipo salvaje, mientras que los mutantes exhibieron los siguientes porcentajes: Mut11 (70,29%), Mut7 (67,88%), Mut14 (63,31%) y Mut17 (55,62%). (Cifra 8)Es importante destacar que estos porcentajes son altamente consistentes con la abundancia de dsRNA en los productos. (Figura 5)Estos resultados indican una reducción significativa en la actividad de la transferasa terminal de los mutantes, lo que, junto con la disminución de la actividad de RDRP, contribuye a la disminución de dsRNA.En concreto, la actividad de la transferasa terminal puede desempeñar un papel más crucial, como lo demuestra la menor acumulación de ARN n>0 observada en Mut17, que también exhibe la menor producción de ARN bicatenario. (Figura 5 y Figura 8).
Cifra 7Actividad relativa de RDRP
Cifra 8Heterogeneidad en el extremo 3' de los productos de ARN
Conclusión
Este estudio proporciona una metodología sólida para identificar mutantes con un contenido reducido de ARNbc y aísla con éxito múltiples mutantes de ARNbc que tienen una actividad reducida de la ARN polimerasa dependiente de ARN y de la transferasa terminal. Refuerza sustancialmente la validación de la seguridad y la eficacia integrales de las terapias con ARNm, lo que subraya sus profundas implicaciones para el avance de las vacunas de ARNm y las aplicaciones de terapia génica.
Al mismo tiempo, la empresa matriz Yeasen También ha lanzado un producto T7 RNAP que reduce significativamente dsRNA Contenido. Varios socios ya han probado los mutantes de ARN polimerasa T7 modificados desarrollados por Molefuture. Y el producto ha sido muy bien recibido por los clientes. Nuestros clientes creen que el uso de la nueva enzima simplifica el proceso de purificación del ARNm. y reduce en gran medida la inmunogenicidad de la IVT productos, demuestra un rendimiento sobresaliente en múltiples escenarios de aplicación, lo que demuestra su amplio potencial de aplicación en el campo biofarmacéutico.
Información de pedidos
Los siguientes son productos representativos ofrecidos por Yeasen. Hay tamaños adicionales disponibles. Nuestros productos están altamente optimizados para funcionar en conjunto, para ayudar a garantizar un rendimiento y una reproducibilidad superiores. También podemos proporcionar servicios personalizados. Si está interesado en un producto que no se muestra, comuníquese con nosotros y trabajaremos con usted para satisfacer sus necesidades.