Introducción a organoides
Los organoides son cultivos celulares tridimensionales en los que las células madre están incrustadas en un gel matriz. Bajo la influencia de inhibidores/activadores químicos de moléculas pequeñas, citocinas, y aditivos medianos, Estos cultivos se desarrollan hasta convertirse en estructuras de tejidos similares a órganos.
Caracterización de organoides
Organoides tener el capacidad a auto-renovarse, mantener el fisiológico estructura y función del tejido de origen, y se conocen como "microorganismos en una placa de Petri". Utilizando la autorrenovación, Capacidad de diferenciación y autoorganización de las células madre, Los organoides se pueden criopreservar para su uso como biobancos y expandido indefinidamente. Los organoides exhiben una alta complejidad y se parecen más al estado in vivo en comparación con los cultivos celulares 2D tradicionales.
![Figure 1. Organoid culture of human colon adenocarcinoma cells [1]](https://cdn.shopify.com/s/files/1/0803/9419/1166/files/1_5935b867-79e5-4a23-859d-b65fcd8e4c44_1024x1024.png?v=1740728801)
Cifra 1. Organoide cultura de humano colon adenocarcinoma células [1]
Solicitud de organoides
Los organoides permiten una simulación superior del entorno in vivo, Reducir la brecha entre los modelos animales y los estudios celulares. Son herramientas poderosas para la investigación tumoral., Prueba de detección de drogas, medicina regenerativa, y otros campos, con aplicaciones que van desde la inducción de tejido funcional hasta estudios clínicos traslacionales y se han utilizado ampliamente en una variedad de aspectos de la investigación, como la inducción de tejido funcional., modelado de enfermedades, Prueba de detección de drogas, pruebas antiinflamatorias, Estudios clínicos finales y otras investigaciones, y se han utilizado en investigación básica y aplicaciones translacionales..Tiene grandes perspectivas de aplicación en la investigación básica y en aplicaciones traslacionales.
Con el desarrollo continuo de Sistemas de cultivo de organoides y técnicas experimentales: los cultivos de organoides se han utilizado para una variedad de tejidos y órganos, incluidos los intestinos (intestino delgado/colon), estómago, hígado, corazón, pulmones, próstata, páncreas, riñones, glándulas mamarias, cerebro, retina, y el oído interno.
Los organoides derivados de células madre tumorales también han comenzado a mostrar un gran potencial para ayudar a comprender el mecanismo del desarrollo tumoral., detección de sensibilidad a los medicamentos, y promover la medicina de precisión y el diagnóstico personalizado. Varios artículos de Cell and Science han demostrado que los organoides tumorales tienen una alta sensibilidad y especificidad para predecir la eficacia de los medicamentos contra el cáncer., Se ha demostrado que los organoides tumorales son útiles para predecir las respuestas de los pacientes a los medicamentos contra el cáncer y ayudar a desarrollar regímenes farmacológicos personalizados.
1.Estudio de los mecanismos del desarrollo: La capacidad de diferenciación que poseen los organoides puede ser utilizada en el estudio de los procesos de desarrollo embrionario y sus mecanismos.
Los organoides regulan procesos inducidos por vías de señalización como Wnt y BMP, que puede utilizarse para estudiar el desarrollo de órganos como el cerebro, páncreas y estómago.[2][3][4]
2.Modelado de daños por enfermedades: Tejidos u órganos específicos inducidos por organoides que pueden utilizarse para la investigación en modelos de enfermedades específicas.
El equipo de Bing Zhao y Xinhua Lin aplicó un modelo de infección de órganos similar al humano para estudiar el mecanismo molecular de la infección por SARS-CoV-2 (el nuevo coronavirus) y el daño al hígado., que proporciona una herramienta importante para el estudio de la patogénesis del neocoronavirus y el posterior desarrollo de fármacos.[5]
El grupo de investigación de Deng Hongkui en la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad de Pekín ha construido un nuevo organoide del intestino delgado, un hiperorganoide con características de regeneración de lesiones in vitro mediante el uso de pequeñas moléculas y citocinas para la estimulación. Este organoide tiene la característica de ser capaz de amplificar y mantener el genoma en la transmigración a largo plazo., Promover la reparación de daños en los tejidos del colon., y aliviar los síntomas patológicos en modelos animales de colitis aguda.[6]
3.Medicina regenerativa: organoides derivados de células madre, que son capaces de reparar o reemplazar tejidos dañados o enfermos para restaurar la función normal del tejido., Tienen una amplia gama de aplicaciones en terapia celular., incluyendo otras enfermedades neurodegenerativas, diabetes, enfermedades cardiovasculares, retinopatía y lesiones de la columna vertebral.
Como nueva modalidad terapéutica en el campo de la medicina regenerativa, DA01 utiliza las pequeñas moléculas SB-431542 (Cat#53004ES), LDN193189 (Número de catálogo 53012ES), Chir-99021
(Cat.#53003ES), y Y-27632 (Cat. n.° 53006ES), (Cat. n.° 52604ES), y proteína Sonic Hedgehog (Shh) (Cat#92566ES), (Cat. n.° 92589ES), Para estimular la diferenciación de células madre pluripotentes en neuronas dopaminérgicas y su trasplante en las zonas lesionadas del cerebro de pacientes con enfermedad de Parkinson avanzada., Proporcionar nuevas direcciones e ideas para el tratamiento de la enfermedad.[7]
4.Pruebas de toxicidad y eficacia de medicamentos: Uso de organoides para verificar la toxicidad farmacocinética de nuevos fármacos en órganos o tejidos específicos., Proporcionar soporte de datos para el desarrollo de nuevos fármacos.
La nefrotoxicidad del cisplatino (cisplatino) se verificó utilizando el organoide renal Hyman.[8]
5.Prueba de detección de drogas: Los organoides derivados de células madre se pueden utilizar para probar in vitro las respuestas a los medicamentos., Proporcionar apoyo teórico para la detección de drogas.
Los órganos colónicos se pueden utilizar para estudiar regímenes de dosificación en pacientes con mutaciones CFTR, y los órganos tumorales se pueden utilizar para evaluar la dosificación individualizada en los pacientes.[9]
La evolución de los organoides
Fuentes de organoides
Los organoides normales se derivan principalmente de células madre., que incluyen células madre pluripotentes (PSC) y células madre adultas (ASC), De las cuales las células madre pluripotentes incluyen las células madre embrionarias (CME)., células madre pluripotentes inducidas (Células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En comparación con las células madre pluripotentes, Las células madre adultas tienen la ventaja de un modelado fácil y rápido., pero la desventaja es que las estructuras organoides construidas son relativamente simples. Las estructuras organoides construidas por células madre pluripotentes son más complejas.
Cultivo de organoides
| Ohrganoid Tipo | Requerido Scentro comercial METROmolécula | Requerido GRAMOCrecimiento Factores | Medios de comunicación y Aditivos |
| Intestino delgado | Y-27632, SB-202190, A 83-01, Gastrina, Nicotinamida | FCE, Vaso, R-Espondina 1, Wnt-3a | HEPES, Solución de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina, NORTE-2 |
| GRAMOÁstrico | Y-27632, SB-202190, A 83-01, Gastrina I, Nicotinamida | FGF-10, FCE, Vaso, R-Espondina 1, Wnt-3a | HEPES, Solución de L-alanil-L-glutamina, penicilina- estreptomicina |
| yoenfermedad del hígado | Y-27632, A 83-01, ADAPTACIÓN, Forskolina, Gastrina, Nicotinamida, Prostaglandina E2 | BMP-4, FCE, FGF-básico, FGF-10, factor de crecimiento humano, Vaso, Wnt-3a | NORTE-2, HEPES, L-solución de alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
| riñón | Chir-99021、Ácido retinoico | BMP-2、BMP-4、BMP-7、FGF-básico 、FGF-9 | HEPES, Solución de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
| youngs | Chir-99021、SB-431542 | Activina A、FGF-básico、FGF-4、Vaso | HEPES, Solución de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
| PAGáncreas | Gastrina I、Un 83-01、Nicotinamida | FGF-10、 FCE、Vaso、R-Espondina 1、Wnt-3a | HEPES, Solución de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
| PAGrostato | Y-27632、SB-202190、Un 83-01、Nicotinamida、Prostaglandina E2、Testosterona | FCE、Activina A、FGF-básico、FGF-10、Vaso、R-Spond en 1、Wnt-10b | HEPES, Solución de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
| METROglándula mamaria | Y-27632 | Aquí gulin β-1、R-Espondina 1、R-Spondin 2、Vaso、FCE、 FGF-básico、FGF-10、Wnt-3a、Prolactina | HEPES, Solución de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
| REtina | Chir-99021、Y-27632 | Silencio、Wnt-3a | HEPES, Solución de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
| Ioído interno | SB-431542、Un 83-01 | BMP-4、 FGF-básico | HEPES, Solución de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
| Blluvia | Y-27632、MK-2206、GDC-0068、Dorsomorfina | FGF-básico、Vaso、1 corona danesa、 FCE、BDNF、GDNF (Global Density Foundation) | B-27, HEPES, Solución de L-alanil-L-glutamina, penicilina-estreptomicina |
SResumen De sMoléculas pequeñas comúnmente utilizadas en el cultivo de organoides: súper útil, ¡No olvides marcarlo como favorito!
❶ Y-27632 (Cat. n.° 53006ES), Cat#52604ES): Es un potente inhibidor de la Rock, que inhibe p160ROCK (Ki=140 nM) y ROCK-II (IC50=800 nM) de forma competitiva con ATP, y también inhibe PRK2 (IC50= 600 nM), y generalmente se agrega en el primer momento del cultivo en la placa de semillas., pero no en la cultura posterior.Y-27632 (10 µM) puede inhibir la apoptosis de células madre, Mejorar la eficiencia de la clonación y prolongar la progenie celular tratando células madre embrionarias humanas con Y-27632 (10 µM) durante 1 h.
La concentración de trabajo recomendada es 10 micrometros
❷ SB-202190 (Cat#53005ES): Un potente inhibidor de la quinasa p38 MAPK que actúa sobre p38α/β. SB202190 induce la diferenciación de células madre embrionarias humanas en cardiomiocitos., Promueve la autorrenovación de las células madre neuronales, y puede utilizarse en cultivos de organoides gastrointestinales y mamarios.
Concentración de disolución recomendada: 10 mg disueltos a 10 mM añadiendo 3,018 mL de solución DMSO y almacenados a -20 °C en porciones.
La concentración de trabajo recomendada es 10 micrometros
❸ CHIR-99021 (Cat# 53003ES): Un derivado de aminopirimidina que actúa como inhibidor de GSK-3 (GSK3α/β), que induce la diferenciación de células madre embrionarias humanas hacia el endodermo, y se utiliza en cultivos de organoides renales y retinianos. Chir-99021, en combinación con otros reactivos, Estimula la reprogramación de células somáticas en células madre.
Concentración de disolución recomendada: 5 mg disueltos a 3 mM añadiendo 3,58 mL de solución DMSO y almacenados a -20 °C en porciones.
El rConcentración de trabajo recomendada: 3 μM
❹ A 83-01 (Cat#53002ES): es un inhibidor de la vía Activin/NODAL/TGF-β que inhibe la actividad de la quinasa ALK5/4/7 y generalmente se utiliza en el hígado., próstata, y cultivos de organoides mamarios, y se utiliza a menudo para inhibir la diferenciación de iPSC y mantener la autorrenovación de las células in vitro. Concentración de disolución recomendada: 5 mg añadidos a 5,93 ml de solución de DMSO para disolver a 2 mM, -20 ℃ dividido y almacenado. (Nota especial: Este producto es inestable en estado de solución), Se recomienda usarlo ahora.)
El rConcentración de trabajo recomendada: 2 μM
❺ Gastrina I (Cat#53007ES): La gastrina es una hormona peptídica gastrointestinal endógena que estimula la secreción de ácido gástrico de las células del revestimiento gástrico. La gastrina se une al receptor de colecistoquinina B (CCKBR), que aumenta el Ca2+ intracelular, promueve la producción de fosfatidilinositol, y la activación de la proteína quinasa C. La gastrina también participa en la proliferación y diferenciación de las células epiteliales gástricas y se utiliza en el estudio de órganos similares al tracto gastrointestinal. La adición de gastrina es necesaria para prolongar la supervivencia de los organoides intestinales y hepáticos en cultivo.
Concentración de disolución recomendada: 1 mg disuelto a 0,2 mM añadiendo 2,38 mL de solución de amoniaco al 1% y almacenado a -20 °C en porciones.
El rConcentración de trabajo recomendada: 10 nM
❻ Nicotinamida Nicotinamida (Cat# 51402ES): Una vitamina B3 involucrada en una variedad de reacciones redox enzimáticas y se utiliza en afecciones gastrointestinales., hígado, y cultivos de organoides mamarios.
La nicotinamida se utiliza junto con citocinas y otros productos bioquímicos para ejercer propiedades antiinflamatorias y promover la diferenciación de las MSC en células productoras de insulina., para inhibir la actividad de las sirtuinas, y promover la formación de organoides y prolongar la vida útil de los mismos.
Concentración de disolución recomendada: 100 mg disueltos a 100 mM añadiendo 8,19 mL de H2O (o DMSO) y almacenados a -20 °C en porciones.
El rConcentración de trabajo recomendada: 10 mM
❼ Tricoteceno de forskolina (Cat#51001ES): activa la adenilato ciclasa y se usa comúnmente para aumentar los niveles intracelulares de AMPc. La forskolina induce la diferenciación de muchos tipos de células y activa PXR y FXR. Tiene efectos anticoagulantes y antihipertensivos plaquetarios., Cuando se combina con otras moléculas pequeñas, Puede inducir la reprogramación de fibroblastos a células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Esta sustancia debe añadirse a los cultivos de organoides hepáticos. Se reprograman en células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Debe añadirse durante el cultivo de órganos similares al hígado. Concentración de trabajo recomendada: 1-10 μM
❽ Prostaglandina E2 (Cat#60810ES): La prostaglandina E2 (PGE2) regula muchos sistemas fisiológicos., Media la proliferación y diferenciación celular al unirse a receptores específicos., Es necesario agregarlo a cultivos de órganos similares al hígado y a la próstata., y se ha implicado en la conservación del músculo liso., inflamación, fertilidad, Regulación del ciclo del sueño e integridad de la mucosa gástrica.
Concentración de disolución recomendada: 1 mg añadido a 0,28 mL de solución de DMSO disuelta a 10 mM y almacenada a -20 °C en porciones.
Concentración de trabajo recomendada: 500 nM
❾ N-acetil-L-cisteína (Cat#50303ES): La N-acetil-L-cisteína (NAC) es un precursor del antioxidante glutatión., que tiene propiedades antioxidantes, y un inhibidor de ROS que inhibe la apoptosis en células neuronales, y que es necesario añadir en la mayoría de los cultivos de organoides.
Concentración de disolución recomendada: 2 g añadidos a 24,51 mL de H2O (o DMSO) disuelto a 500 mM y almacenado a -20 °C en porciones.
Concentración de trabajo recomendada: 1 mM
Producto Recomendacionnorte
Compuestos de moléculas pequeñas (inhibidores/activadores)
| Nombre del producto | Número de catálogo | Sespecificación |
| Retinoico ácido (retinoico ácido retinoico ácido) | 100 mg/500 mg/l gramo | |
| A 83-01 | 1 mg/5 mg/10 mg | |
| CHIR-99021 | 2 mg/5 mg/10 mg | |
| SB-431542 | 5 mg/10 mg/50 mg | |
| SB-202190 | 5 mg/10 mg/25 mg | |
| Y-27632 | 1 mg/5 mg/10 mg | |
| Gastrina I (humano) | 1 mg/5 mg | |
| MK-2206 2HCl | 1 mg/5 mg/10 mg | |
| GDC-0068 (Ipatasertib; RG7440; GDC0068) | 53009ES | 1 mg/5 mg/10 mg |
| (dorsomorfina 2HCl) | 53010ES | 1 mg/5 mg/10 mg |
| Y-27632 dihidrocloruro | 5 mg/10 mg/25 mg | |
| Nicotinamida | 1 cinco gramos gramo | |
| ADAPTACIÓN (GSI-IX, LY-374973) | 5 mg/25 mg | |
| Forskolina Cabello Garganta | 10 mg/50 mg/100 mg/l gramo | |
| Prostaglandina (PÁGINA PRINCIPAL) E2 Prostaglandina E2 | 60810ES | 1 mg |
| Testosterona | 60803ES | 1 cinco gramos gramo |
| CNA (N-acetil-L-cisteína) | 50303ES | 2 gramo |
| Medias Rojas RepSox | 5 mg/10 mg/25 mg | |
| LDN193189 (DM-3189) | 53012ES | 5 mg/10 mg |
Medios de comunicación y suplementos
| Número de catálogo | Sespecificación | |
| HEPES Gratis Ácido Celúla Cultura Calificación | 60110ES | 100 g/500 gramo |
| L-alanil-L-glutamina solución, 200 millones L-alanil-yo-glutamina, 200 millones | 60701ES | 20 ml/100 ml/500 ml |
| Penicilina-Estreptomicina (100×), Adecuado para Celúla Cu Cultura Penicilina-Estreptomicina (Dual Anticuerpo) para do ana Cultura |
100 ml | |
| B-27 sin suero medio, 50 incógnita | 60703ES | 10 ml |
| N-2 suplemento, suero gratis, 100X N-2 suero gratis aditivo, 100× | 60706ES | 5 ml |
Citocina
| Nombre del producto | Número de catálogo | Sespecificación |
| Recombinante Humano Activina A | 10 μg/100 microgramos/500 microgramos | |
| 10 μg/100 microgramos/500 microgramos | ||
| Recombinante Humano DKK-1 | 20 μg/100 microgramos/500 microgramos | |
| Recombinante Humano FCE | 100 microgramos/500 microgramos | |
| Recombinante Humano BFGF | 10 μg/100 microgramos/500 microgramos | |
| Recombinante Humano FGF-4 | 5 μg/100 microgramos/500 microgramos | |
| Recombinante Humano FGF-9 | 91305ES | 5 μg/100 microgramos/500 microgramos |
| Recombinante Humano FGF-10 | 91306ES | 5 μg/100 microgramos/500 microgramos |
| Recombinante Humano GDNF (Global Density Foundation) | 10 μg/100 microgramos/500 microgramos | |
| Recombinante Humano Vaso | 5 μg/100 microgramos/500 microgramos | |
| Recombinante Humano NRG1-beta1 | 10 μg/100 microgramos/500 microgramos | |
| Recombinante Humano R-Spondin 1 | 92274ES | 100 microgramos/1 mg |
| Recombinante Humano Silencio | 5 μg/100 microgramos/500 microgramos | |
| Recombinante Humano BAFF | 5 μg/100 microgramos/500 microgramos | |
| Recombinante Humano CD40 s Ligando | 10 μg/100 microgramos/500 microgramos | |
| Recombinante Humano BMP-4 | 10 μg/100 microgramos/500 microgramos | |
| Recombinante Humano factor de crecimiento humano | 5 μg/100 microgramos/500 microgramos | |
| Recombinante Humano BDNF | 5 microgramos/20 μg/100 microgramos |
Mini-aula: Los compuestos de moléculas pequeñas son compuestos con un peso molecular menor a 1000 Da (especialmente menor a 500 Da) y tienen actividad biológica.A diferencia de las citocinas y las proteínas, Las moléculas pequeñas pueden entrar en la célula a través de la membrana celular y cumplir sus funciones biológicas. Los compuestos de moléculas pequeñas tienen una amplia gama de objetivos y se han utilizado ampliamente en muchas investigaciones importantes. campos en las ciencias de la vida, como el tallo células, organoides, inmunología, neurobiología, epigenética, apoptosis, canales iónicos, Oncología y transducción de señales.
Referencias
[1] Sato T, Stange DE, et al. Expansión a largo plazo de organoides epiteliales de colon humano, adenoma, adenocarcinoma y epitelio de Barrett. Gastroenterología. Noviembre de 2011;141(5):1762-72. doi:10.1053/j.gastro.2011.07.050. Publicación electrónica 2 de septiembre de 2011. PMID: 21889923.
[2] Lancaster MA, Renner M, et al. Los organoides cerebrales modelan el desarrollo del cerebro humano y la microcefalia. Nature. 2013;501(7467):373-379. doi:10.1038/nature12517.
[3] Greggio C, et al. Nichos tridimensionales artificiales deconstruyen el desarrollo del páncreas in vitro. Desarrollo. 2013.140(21):4452-4462. http://dx.doi.org/10.1242/dev.096628.
[4] McCracken KW, et al. Modelado del desarrollo humano y la enfermedad en organoides gástricos derivados de células madre pluripotentes. Nature. 2014.516(7531):400-404. http://dx.doi.org/10.1038/nature13863.
[5] Zhao B, Ni C, et al. Recapitulación de la infección por SARS-CoV-2 y daño a los colangiocitos con organoides ductales del hígado humano. Protein Cell. 2020 Oct;11(10 ):771-775. doi: 10.1007/s13238-020-00718-6. PMID: 32303993; PMCID: PMC7164704.
[6] Qu M, Xiong L, et al. Establecimiento de cultivos de organoides intestinales que modelan la regeneración epitelial asociada a lesiones. Cell Res. 2021 Mar;31(3). 259-271. doi: 10.1038/s41422-020-00453-x. Publicación electrónica 8 de enero de 2021. PMID:
[7] 33420425; ID del PMC: PMC8027647.
[8] BlueRock Therapeutics anuncia que el primer paciente recibió DA01 en un estudio de fase 1 en pacientes con enfermedad de Parkinson avanzada. Comunicado de prensa de BlueRock Therapeutics: 8 de junio de 2021.
[9] Takasato M, Er PX, et al.Los organoides renales de células iPS humanas contienen múltiples linajes y modelan la nefrogénesis humana. Naturaleza. 2015.526(7574):564 -568. http://dx.doi.org/10.1038/nature15695.
[10] Spence JR, Mayhew CN, et al. Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes humanas en tejido intestinal in vitro. Nature. 2011.470(7332):105-109. http://dx.doi.org/10.1038/nature09691.