Descripción
El kit Hieff® Blood Advanced Direct PCR es un kit que puede amplificar directamente muestras de sangre completa sin purificación de ADN o pretratamiento de la muestra, y es compatible con sangre fresca, sangre refrigerada (congelada) y manchas de sangre seca comerciales que contienen anticoagulantes convencionales como EDTA, heparina, citrato, etc. El kit contiene una combinación de ADN polimerasa modificada genéticamente con alta fidelidad y resistencia a los inhibidores de PCR, tampón de PCR Hieff® Blood Advanced 2× con fuerte factor de elongación, factor de mejora de la amplificación y sistema de tampón optimizado para amplificar eficientemente 8 kb de fragmentos genómicos en condiciones de extensión rápida y establecer un tiempo de extensión de 3-5 s/kb para fragmentos por debajo de 2 kb, acortando significativamente el tiempo de identificación y prueba de la muestra de sangre.
Presupuesto
| Fidelidad (contra Taq) | 1 × |
| Arranque en caliente | Sí |
| Sobresalir | 3'-A |
| Polimerasa | Taq ADN polimerasa (Cat.: 10726) |
Componentes
| No. | Nombre | 10188ES20 | 10188ES60 |
| 10188-A | 2× Hieff® Tampón PCR avanzado para sangre | 500 micrasyo | 2,5 ml |
| 10188-B | Hieff® Mezcla avanzada de ADN polimerasa de alta fidelidad | 20 micrasyo | 100 μl |
| 10188-C | Mezcla de cebadores de control positivo (10 μM cada uno) | 100 μl | 200 μL |
| 10188-D | Tampón de carga de ADN 10× | 1 ml | 1 ml |
Instrucciones
Sistemas de reacción de PCR recomendados.
| Componentes | Volumen (μL) |
| DdH2Oh | hasta 50 μL |
| 2× Hieff® Tampón PCR avanzado para sangre | 25 μL |
| Cebador directo (10 μM) | 2 μL |
| Cebador inverso (10 μM) | 2 μL |
| Hieff® Mezcla avanzada de ADN polimerasa de alta fidelidad | 1 μl |
| Muestra de sangre | incógnita |
2. Se recomienda una concentración final de 0,4 μM por cebador; un valor demasiado alto dará como resultado una amplificación no específica.
3. La concentración óptima de sangre total molde varía de 0,5% a 20%, y el uso recomendado es 10% como condición de prueba inicial, es decir, se agregan 5 μL de sangre total como molde al sistema de reacción de 50 μL, teniendo cuidado de no aspirar coágulos de sangre. Para manchas de sangre seca almacenadas en tarjetas de filtro Whatman®, se pueden tomar aproximadamente 1 mm2 de trozos redondos de papel con manchas de sangre y amplificarlos directamente en la reacción de PCR sin tratamiento previo.
Programa de reacción
| Ciclo paso | Temperatura. | Tiempo | Ciclos |
| Desnaturalización inicial | 95℃ | 5 minutos | 1 |
| Desnaturalización | 95℃ | 15 segundos | 30-35 |
| Recocido | 60℃ | 15 segundos | |
| Extensión | 72℃ | 3-10 segundos/kb | |
| Final extensión | 72℃ | 5 minutos | 1 |
La temperatura de hibridación es un valor Tm genérico o 1-2 °C por debajo del valor Tm del cebador. Si el producto de amplificación es menos específico, se puede establecer un gradiente de temperatura de hibridación para encontrar las condiciones óptimas de hibridación.
Un tiempo de extensión de 10 s/kb puede amplificar la mayoría de los fragmentos objetivo por debajo de los 8 kb, y de 3 a 5 s/kb puede amplificar la mayoría de los fragmentos por debajo de los 2 kb. Si la eficiencia de amplificación es baja, el tiempo se puede extender adecuadamente a 20-30 s/kb, y no debe superar los 60 s/kb.
Envío y almacenamiento
Los productos deben almacenarse a -15 ℃. ~-25℃ para 1 año
Cifras
Notas
1. Se recomienda que la plantilla de sangre se utilice como 10% del volumen total de reacción, es decir, se agregan 5 μL de sangre completa al sistema de reacción de 50 μL como plantilla, teniendo cuidado de no aspirar coágulos de sangre.
2. Un tiempo de extensión de 10 s/kb puede amplificar la mayoría de los fragmentos de destino de menos de 8 KB, y de 3 a 5 s/kb puede amplificar la mayoría de los fragmentos de menos de 2 KB. Si la eficiencia de amplificación es baja, el tiempo se puede extender a 30 s/kb.
3. Después de la reacción de PCR, se recomienda centrifugar el producto de reacción a 4000 rpm (1000× g) durante 1-3 minutos para precipitar los fragmentos de células sanguíneas y tomar el sobrenadante para el análisis posterior.
4. Este producto no se puede utilizar directamente para diagnóstico médico.
5. Para su seguridad y salud, utilice bata de laboratorio y guantes desechables.
Pago y seguridad
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Consulta
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Preguntas frecuentes
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