Quick T4 DNA Ligase es un producto de enzima única que se puede utilizar para la ligación de fragmentos de ADN y adaptadores en el proceso de construcción de bibliotecas NGS. Este producto ha sido verificado mediante secuenciación de alto rendimiento y tiene una calidad excelente. Para los clientes que no necesitan un ajuste del sistema experimental, se recomienda comprar el módulo de ligación de ADN de ritmo rápido Hieff NGSTM (n.° de cat. 12607).

Componentes del producto

Envío y almacenamiento

El producto se envía con bolsas de hielo y puede almacenarse a -20 °C durante dos años.

Definición de unidad

En un sistema de reacción de ligadura de 20 μL, cuando 6 μg de λDNA-Hind Ⅲ reaccionan a 16℃ durante 30 minutos, la cantidad de enzima necesaria para lograr una ligadura de más del 50% de los fragmentos de ADN se definió como una unidad (U).

Precauciones

1. Si se produce una pequeña cantidad de precipitación cuando el tampón se está derritiendo, inviértalo y mezcle bien antes de usar;

2. Para su seguridad y salud, utilice bata de laboratorio y guantes desechables durante la operación.

3. ¡Este producto es SÓLO para uso en investigación!

Instrucciones

1. Los kits de construcción de bibliotecas de ADN convencionales actuales generalmente no se purifican después de la reparación de extremos y el tratamiento de cola A, y realizan directamente la ligadura del adaptador. Consulte la siguiente preparación para el sistema de reacción. Agite bien, centrifugue brevemente e incube durante 15 minutos a 20 °C.

[Nota]: *El 50% PEG 6000 no está incluido en el kit, debe prepararlo usted mismo.

**Consulte la siguiente tabla para conocer la cantidad de adaptadores.

***La cantidad de Quick T4 DNA Ligase utilizada se puede agregar de 1 a 5 μL según sea necesario.

2. La calidad y la concentración de los adaptadores utilizados afectan directamente la eficiencia de la ligadura y el rendimiento de la biblioteca. El uso excesivo de adaptadores puede producir más dímeros de adaptadores, mientras que un uso menor puede afectar la eficiencia de la ligadura y el rendimiento de la biblioteca. La siguiente tabla enumera la cantidad recomendada de adaptadores utilizados en diferentes situaciones de entrada de ADN con este kit.

[Nota]: Mol de ADN de entrada (pmol) ≈ ADN de entrada (ng)/ [0,66 × longitud promedio del ADN de entrada (pb)].

Ejemplo de cálculo de ligadura de adaptador: ¿Cuánto adaptador se debe agregar cuando el ADN de entrada es de 100 ng y la longitud es de 300 pb?

Paso 1: Calcule la cantidad de moles de ADN de entrada. Fórmula: Mol de ADN de entrada (pmol) ≈ ADN de entrada (ng)/ [0,66 × longitud promedio del ADN de entrada (pb)]; Mol de ADN de entrada (pmol) = 100 ÷ (0,66 × 300) = 0,5 pmol;

Paso 2: De acuerdo con la tabla anterior, calcule la cantidad de moles de adaptador agregado. Cuando el ADN de entrada es de 100 ng, la relación molar de adaptadores: ADN de entrada es de 100:1 y la cantidad de moles de adaptadores agregados = 100 × 0,5 pmol = 50 pmol;

Paso 3: Calcule el volumen de adición del adaptador. Concentración del adaptador = 15 μmol/L (si utiliza un adaptador de otra empresa, debe determinar su concentración de acuerdo con sus instrucciones); Volumen del adaptador añadido = moles de adaptador añadido (50 pmol) ÷ concentración del adaptador (15 μmol/L) = 3,34 μL (Nota: 15 μmol/L = 15 pmol/μL);

En resumen, el volumen al que se puede añadir el adaptador es de 3,4 μL. (Nota: El volumen máximo de adición del adaptador no supera los 5 μL).