Descripción
El kit de síntesis de ARN de alto rendimiento T7 optimiza el sistema de reacción de transcripción. El kit puede sintetizar el ARN monocatenario de manera eficiente mediante el uso de la ARN polimerasa T7, el ADN bicatenario lineal con la secuencia promotora T7 como plantilla y los NTP como sustrato para controlar la secuencia de ADN aguas abajo del promotor. Durante la transcripción, se pueden agregar nucleótidos modificados al sustrato para preparar ARN marcado con biotina o colorante.
Este kit puede sintetizar transcripciones largas y cortas. Se pueden producir 100-200 μg de ARN con 1 μg de ADN de plantilla como entrada. El ARN sintetizado por transcripción se puede utilizar para diversas aplicaciones posteriores, como investigación de la estructura y la función del ARN, protección de ARNasa, hibridación de sondas, ARNi, microinyección e in vitro. traducción.
Figura 1: In vitro Proceso de transcripción del ARN
Característica
- Hasta 180 μg de ARN por reacción a partir de 1 μg de la plantilla de control
- Sistema de reacción optimizado para el proceso IVT
- Disminuir la producción de dsRNA
- Mayor integridad y pureza del ARN
Solicitud
- In vitro Síntesis de ARN
Componentes
| Componentes No. | Nombre | 10623ES50 (50T) | 10623ES60 (100 T) | 10623ES70 (500 toneladas) |
| 10623-A | Mezcla de ARN polimerasa T7 | 100 μl | 200 μL | 1 ml |
| 10623-B | 10×Búfer de transcripción | 100 μl | 200 μL | 1 ml |
| 10623-C | ATP (100 mM) | 100 μl | 200 μL | 1 ml |
| 10623-D | CTP (100 mM) | 100 μl | 200 μL | 1 ml |
| 10623-E | GTP (100 mM) | 100 μl | 200 μL | 1 ml |
| 10623-F | Cable UTP (100 mM) | 100 μl | 200 μL | 1 ml |
| 10623-G | Plantilla de ADN de control (500 ng/μL) | 10 μl | 20 μL | 100 μl |
Envío y almacenamiento
Transporte con hielo seco. Conservar a una temperatura de entre -15 °C y -25 °C. Válido durante dos años.
Cifras
Figura 1. El ARN estándar se sintetizó in vitro utilizando el kit de síntesis de ARN T7.
La reacción se incubó en un instrumento de PCR a 37 ℃ durante 2 h y luego se purificó mediante perlas magnéticas (Cat. n.° 12602). El resultado del rendimiento se analizó mediante un espectrofotómetro NanoDrop como se muestra en la Figura 1.
Figuras 2. Demostración de la transcripción de diferentes longitudes de ARN por el kit T7 respectivamente en el electroforetograma (Figuras 2A), el diagrama de electroforesis capilar (Figuras 2B) y el cromatograma (Figuras 2C).
Figura 3. Síntesis de ARN con capuchón in vitro.
La reacción se incubó en un instrumento de PCR a 37 ℃ durante 2 h y luego se purificó con perlas magnéticas (Cat. n.° 12602). El resultado del rendimiento se analizó con un espectrofotómetro NanoDrop, como se muestra en la Figura 3A. El resultado de integridad se analizó mediante electroforesis capilar, como se muestra en la Figura 3B.
1. Bajo rendimiento de transcripción
La calidad de la plantilla está estrechamente relacionada con el rendimiento. Si el rendimiento del grupo experimental es significativamente inferior al del grupo de control, las posibles razones son:
① La plantilla experimental contiene componentes inhibidores;
② La plantilla tiene algo mal.
Sugerencias:
① Vuelva a purificar la plantilla;
② Determinar la cuantificación de la plantilla y su integridad;
③ Prolongar el tiempo de reacción;
④ Aumente la cantidad de entrada de plantilla;
⑤ Pruebe otros promotores y ARN polimerasas.
2. Bajo rendimiento de transcripciones breves
Un fragmento de iniciación de transcripción corto inhibirá la reacción. Cuando el producto de transcripción es menor a 100 nt, extender el tiempo de reacción a 4-8 hs o aumentar la cantidad de plantilla a 2 μg aumentará el rendimiento de ARN.
3. La longitud de la transcripción del ARN es mayor de lo esperado
Si la electroforesis muestra que la banda del producto es mayor que el tamaño esperado, las posibles razones:
①Es posible que la plantilla de plásmido no esté completamente linealizada;
②El extremo 3' de la cadena sensorial tiene una estructura prominente;
③El ARN tiene una estructura secundaria que no está completamente desnaturalizada.
Sugerencias:
①Verifique si la plantilla está completamente linealizada y, si es necesario, realice una linealización adicional;
②Seleccione una enzima de restricción adecuada para evitar salientes 3', o utilice el fragmento Klenow/ADN polimerasa T4 para completar la transcripción antes de continuar;
③Utilice gel desnaturalizado para detectar productos de ARN.
4. La longitud de la transcripción del ARN es menor de lo esperado
Si la electroforesis muestra que la banda del producto es más pequeña que el tamaño esperado, las posibles razones:
①La plantilla contiene una secuencia de terminación similar a la ARN polimerasa T7;
②El contenido de GC en la plantilla es alto.
Sugerencias:
①Reducir la temperatura de reacción (por ejemplo, 30 °C). A veces, reducir la temperatura puede aumentar la longitud de la transcripción, pero reducirá el rendimiento. O probar diferentes ARN polimerasas para la transcripción;
②Si el contenido de GC de la plantilla es alto, use 42 ℃ para transcribir, o agregar SSB para aumentar el rendimiento y la longitud de la transcripción.
5. Electroforesis de colas de productos de transcripción.
Durante la electroforesis se produce un fenómeno de cola.
Posibles razones:
①Contaminado por ARNasa durante la operación experimental;
②Plantilla de ADN contaminada por ARNasa.
Sugerencias:
①Utilice puntas de pipeta y tubos EP libres de ARNasa, use guantes y máscaras de látex desechables, y todos los reactivos están preparados con H2O libre de ARNasa.
②Vuelva a purificar el ADN plantilla.
[1] Dong Z, Zheng N, Hu C, et al.El ARN 8 similar a microARN de Nosema bombycis (Nb-milR8) aumenta la patogenicidad fúngica al modular la expresión del gen BmPEX16 en su huésped, Bombyx mori. Microbiol Spectr. 2021;9(2):e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)
[2] Wang X, Tang S, Ye S, et al. Cuantificación ultrasensible de miR-195-5p circulante con cascada de amplificación por desplazamiento de triple cadena. Talanta. 2022;242:123300. doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)
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