Hieff^™ Celda rápida directa El kit RT-qPCR basado en el colorante SYBR Green es adecuado para la extracción de ARN de todo tipo de células animales (como células de la pared celular y células en suspensión, células de cultivo primario, diversas células madre, células iPS, etc.), sin necesidad de extraer ARN, y se puede utilizar directamente para el análisis de expresión de qPCR, que es corto, fácil de operar y tiene una baja tasa de error. Se necesitan solo 1,5 horas para completar los pasos desde la preparación de la plantilla hasta la reacción de transcripción inversa y el análisis de expresión genética.

El kit incluye reactivos de detección de fluorescencia y transcripción inversa, que pueden utilizarse para el análisis de la expresión genética sin necesidad de comprar reactivos adicionales.

Presupuesto

Componentes

Almacenamiento

El tampón de lisis FCD y el tampón de lavado FCD se fundieron y almacenaron a 4 °C para evitar la contaminación. La solución de detención FCD, la DNasa I, la mezcla RT FCD 4× Hifair™ y la mezcla maestra SYBR qPCR FCD 2× Hieff™ deben almacenarse a entre -25 y -15 ℃.

Instrucciones

1. Preparación de productos de escisión

1)1. Derretir el reactivo a temperatura ambiente, darle la vuelta y mezclarlo suavemente antes de usarlo, y utilizarlo después de una ligera centrifugación para evitar la formación de espuma*.

*La falta de mezcla de los reactivos, el uso de un oscilador para mezclar y la falta de configuración de los reactivos en hielo pueden provocar una disminución en el rendimiento de la reacción.

2) Dependiendo del tipo de célula**, transfiera las células a un tubo de centrífuga y centrifugue a 5000 rpm durante 2 minutos para recolectar las células y aspirar bien el medio. Si las células se cultivan en placas de 96 pocillos, el medio se puede aspirar directamente.

​​​​​​​​3) Agregue 150 μL de tampón de lavado FCD a cada pocillo, lave las células soplando, centrifugue a 5000 rpm durante 2 minutos y aspire el tampón de lavado FCD***.

​​​​​​​​​4) Agregue 48 μL de solución tampón de lisis FCD y 2 μL de solución de DNasa Ⅰ a cada pocillo, sople y mezcle a temperatura ambiente, luego deje reposar durante 5 minutos y luego agregue 2.5 μL de solución de detención FCD después de la incubación****, y luego soplar y mezclar aproximadamente 5 veces para obtener el producto de escisión*****.

** El requisito básico para el número de celdas es 1 × 10⁴ células por pocillo, y este kit se puede utilizar en el rango de 1 × 10³ - 1 × 10⁶ células. Si el número de células es mayor, la cantidad de solución tampón de lisis FCD y solución de DNasaⅠ se puede aumentar proporcionalmente según corresponda.

*** Las condiciones de centrifugación varían de una célula a otra, por lo que debe centrifugarse a una velocidad adecuada para las células que se utilicen.

**** Agregue 2,5 μL de solución de parada FCD a 50 μL de lisado y aumente la cantidad de solución de parada FCD según sea necesario.

***** Para el almacenamiento a largo plazo de soluciones de productos de lisis celular, colóquelas a -20 °C.

5) Derretir 4 x Hifair™ FCD RT Mix a temperatura ambiente y mezclar con una ligera inversión, colocar en hielo y configurar el sistema de reacción de acuerdo con la siguiente tabla:

*******El nivel de uso recomendado es de 2 a 5 μL, trate de no exceder el 45%.

1. Transcripción inversa

Pipetee y mezcle suavemente la solución de reacción preparada anteriormente y realice la reacción de transcripción inversa de acuerdo con el procedimiento de la siguiente tabla:

* La temperatura recomendada para la transcripción inversa es de 55 °C. Para plantillas con un alto contenido de GC o plantillas complejas, la temperatura de transcripción inversa se puede aumentar a 60 °C. El producto de transcripción inversa se puede utilizar directamente para la detección posterior mediante RT-qPCR. Para evitar la inhibición de la reacción de qPCR por parte del sistema de transcripción inversa y obtener el valor de Ct adecuado (10-35), el producto se puede diluir entre 10 y 1000 veces y luego se puede utilizar. Si no se realizan experimentos posteriores durante un corto período de tiempo, Se puede colocar a -20 ℃ para su almacenamiento.

1. PCR cuantitativa de fluorescencia

1) Reacción sistema configuración

Se recomiendan las siguientes proporciones para la preparación de la solución de reacción (preparación en hielo).

*No agregue más de 1/10 del volumen de RT-qPCR del producto de transcripción inversa. Una alta concentración de plantilla puede provocar fácilmente una amplificación no específica. Se recomienda una dilución de 5 a 50 veces. La cantidad recomendada de plantilla es de 4 μL, trate de no exceder los 6 μL. Cuando el rendimiento de la reacción es deficiente, la concentración del cebador se puede ajustar en el rango de 0,2 a 1,0 μmol/L.

2) Procedimiento de amplificación cuantitativa por PCR de fluorescencia (método de dos pasos)

3) Procedimiento de amplificación rápida para PCR cuantitativa fluorescente (método de dos pasos)

* La temperatura de hibridación/extensión y el tiempo de extensión final se pueden ajustar adecuadamente según los requisitos experimentales. El programa rápido es adecuado para la mayoría de los genes, y el programa estándar se puede probar para genes individuales de estructura secundaria compleja.

Notas

1. Este producto es solo para uso de investigación.
2. Por favor, trabaje con bata de laboratorio y guantes desechables, para su seguridad.

Versión EN20230908

Documentos:

Manuales

11172-Hieff™ Celda rápida directa. EN20230908.pdf