El kit de bisulfito para metilación de ADN superrápida de Hieff (basado en columnas) convierte rápidamente las citosinas no metiladas en muestras de ADN en uracilo, mientras que las citosinas metiladas no se modifican. Durante el tratamiento con bisulfito a alta temperatura, el ADN bicatenario se desnaturaliza en cadenas simples. En presencia de HSO3-, los residuos de citosina sufren una desaminación y se convierten en uracilo, mientras que las citosinas metiladas permanecen inalteradas. En la posterior amplificación por PCR, el uracilo se reemplaza por timina (T). El proceso de conversión demora solo 5 minutos, admite una entrada de ADN que varía de 100 pg a 2 μg, y logra una eficiencia de conversión de ≥99 % para las citosinas no metiladas. El ADN convertido es adecuado para aplicaciones posteriores, como la amplificación por PCR y la secuenciación NGS.

Característica

Entrada baja: Adecuado para convertir muestras que van desde 100 pg a 2 μg.

Tiempo de conversión corto: aproximadamente 5 minutos.

Daños mínimos en la muestra: Mantener una buena integridad de la muestra después de la conversión.

Alta eficiencia de conversión: Tasa de conversión ≥99%, altas tasas de conversión en regiones de alto GC con una baja tasa de falsos positivos.

Adecuado para muestras raras, como la conversión de metilación del ADN de una sola célula.

Capaz de conversión de metilación de muestras de ARN.

Producto Componentes

Nota:

Para 10 pruebas por caja: agregue 4,4 mL de etanol anhidro a la solución de lavado.

Para 50 pruebas por caja: agregue 22 ml de etanol anhidro a la solución de lavado.

Después de agregar el etanol anhidro, invierta y mezcle bien, luego guarde para uso futuro. Asegúrese de que la tapa del frasco esté bien cerrada para evitar la evaporación del etanol, que podría afectar el rendimiento del reactivo.

Cifra

Figura 4. La conversión con bisulfito de muestras de ADN genómico humano se realizó utilizando los kits de conversión 12225 y Q de la competencia. Posteriormente, se utilizaron kits de preparación de bibliotecas de ADN monocatenario específicas de metilación para generar bibliotecas. Los datos de rendimiento de la biblioteca y control de calidad se presentan arriba. Los resultados demuestran que al secuenciar las bibliotecas agrupadas de los kits 12225 y Q de la competencia, el kit 12225 produjo una mayor salida de datos, logró una mayor proporción de resultados en el objetivo (%) y exhibió tasas de duplicación más bajas (%).

Envío y almacenamiento

Conservar la solución de conversión 12225-A a temperatura ambiente, protegida de la luz. Conservar los demás componentes a temperatura ambiente. La vida útil es de 12 meses.

Nota:

1. Para garantizar el éxito de los experimentos posteriores, cuantifique con precisión la cantidad total de ADN de entrada durante el paso de conversión. Se recomienda utilizar Qubit 3.0/4.0 para la cuantificación de ADN, con una relación A260/A280 entre 1,7 y 1,9. El rango de ADN de entrada debe estar entre 100 pg y 2 μg, con un rango óptimo de 100 ng a 1 μg. Una entrada de ADN insuficiente puede dificultar la detección posterior, mientras que una entrada excesiva puede reducir la recuperación y la eficiencia de conversión.

2. La solución de conversión, la solución de desulfonación y la solución de lavado contienen componentes volátiles. Después de su uso, cierre las tapas rápidamente y consérvelas a temperatura ambiente.

3. En el caso de las muestras posteriores a la conversión, proceda a realizar los experimentos posteriores de inmediato. Para el almacenamiento a corto plazo, manténgalas a -20 °C y, para el almacenamiento a largo plazo, a -80 °C.

4. Para su seguridad y salud, use bata de laboratorio y guantes desechables durante la operación.

5. ¡Este producto es solo para uso de investigación!

Instrucciones

Preparación de reactivos y consumibles: Tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL, agua sin enzimas, etanol absoluto, tubo de PCR;

yo Conversión de bisulfito:

1) Prepare el tubo de PCR estéril correspondiente según el número de muestras a analizar y prepare el sistema de reacción de acuerdo con la siguiente tabla:

2) Sistema de transformación

Utilice una pipeta para soplar y mezclar el sistema anterior o agítelo en un vórtice y mézclelo durante 5 s, luego centrifugúelo durante un tiempo breve y centrifugue la solución de reacción hasta el fondo del tubo de PCR.

en Nota: 1. En este momento, el volumen total de la solución de reacción en el tubo de PCR es de 200 μL. Para que la transformación sea más completa, la solución de reacción debe dividirse en partes iguales y transferirse a un nuevo tubo de PCR estéril después de soplar y mezclar en el paso 2), y debe ejecutarse el procedimiento de transformación. Después de la conversión, las soluciones de reacción en los dos tubos de PCR se combinaron en la misma columna de purificación para la purificación.

2. Si el volumen de la muestra está entre 20 y 40 μL, reduzca el volumen de la solución de transformación para mantener un volumen total de 200 μL.

3. Si el volumen de la muestra es de 50 μL, se añaden 150 μL de la solución de transformación, el volumen total se mantiene en 200 μL y el tiempo de transformación se extiende a 6-10 minutos.

3) Configuración del programa de conversión de CT

El tubo de PCR se coloca en un instrumento de PCR con un programa preestablecido para llevar a cabo la reacción.

yo Purificación

1) yotransferir 200 μL de la conversión solución a la PAGcolumna de urificacións, centrifugar durante 30-60 s 13000 gramo, deseche el filtrado y coloque la columna de purificación en el dotubo de recoleccións de nuevo;

2) Añadir 100 μL de Tampón de lavado en Columnas de purificación (confirmar que se haya añadido etanol absoluto), centrifugar durante 30-60 s 13000 gramo, deseche el filtrado y coloque la columna de purificación en el dotubo de recoleccións de nuevo;

3) Añadir 200 μL de Tampón de desulfonación dentro del Columnas de purificación , y dejar reposar la reacción a temperatura ambiente durante 20 min. Después de la reacción, centrifugar durante 30-60 s 13000 gramo, desechar el filtrado y colocar el Columnas de purificación en el dotubo de recoleccións de nuevo;

4) Añadir 200 μL de la Tampón de lavado hacia Columnas de purificación, centrifugar durante 30-60 s 13000 gramo Desechar el filtrado y colocar el PAGcolumna de urificacións en el dotubo de recoleccións de nuevo;

5) Repita el paso 4) una vez;

6) Transferir el Columnas de purificación Al tubo de centrífuga de 1,5 mL preparado, agregue 10-30 μL de Tampón de elución al centro de la membrana filtrante después de abrir la tapa y secar, y recoger el ADN después de reposar durante 1 minuto a temperatura ambiente y centrifugar durante 1 minuto a 13000 gramo;

7) Almacenar el ADN temporalmente a -20 ℃. Para un almacenamiento a largo plazo, consérvelo ADN a -80 ℃ y evitar congelaciones y descongelaciones repetidas innecesarias.

Nota: El producto de transformación purificado se puede utilizar directamente en la reacción de PCR o en el proceso de secuenciación posterior.

Manual