Kit de preparación conjunta de bibliotecas de ADN y ARN Hieff NGS® V2 es un kit de co-biblioteca de ADN y ARN para la plataforma de secuenciación Illumina® y MGI®, que contiene un reactivo de síntesis de ADNc y un reactivo de digestión enzimática eficientes. En comparación con la biblioteca tradicional construcción Método, este producto puede completar de manera eficiente la síntesis de ADNc y la biblioteca de ADN y ARN. construcción en un solo tubo. El kit contiene una enzima de alta calidad para la fragmentación de ADN y combina la fragmentación de ADN, la reparación final y la eliminación de dA en un solo paso, lo que reduce significativamente el tiempo y el costo de preparación de la biblioteca. Este kit de preparación de bibliotecas tiene una excelente tasa de conversión de bibliotecas y es aplicable para muestras de todos los animales, plantas, microorganismos, etc. comunes, y también para muestras FFPE. Este kit mejorado que utiliza la última ligasa optimizada reduce en gran medida la tasa de autoligación durante la ligación del adaptador. Además, la introducción de una nueva polimerasa de alta fidelidad mejora aún más la homogeneidad y la fidelidad de la amplificación.

Todos los componentes proporcionados por el kit han sido sometidos a un estricto control de calidad y verificación funcional, lo que garantiza al máximo la estabilidad y repetibilidad de la construcción de la biblioteca.

Presupuesto

Componentes

Nota: * indica que este reactivo no está incluido en este kit y se requieren reactivos adicionales. El kit es compatible con plataformas duales de Ilumina^®&MGI^®, pero mezcla de imprimación adicional (CAT # 13334 Mezcla de imprimación para MGI^® y Cat# 13335 Mezcla de imprimación para Illumina^®) se requiere.

Flujo de trabajo:

Almacenamiento

Este producto debe almacenarse a -25~-15℃ durante 1 año.

Notas

Sobre la operación

1. 1. Por su seguridad, utilice bata de laboratorio y guantes desechables.
2. Descongele los componentes a temperatura ambiente.Después de descongelar, mezcle bien mediante vórtex, gire el tubo brevemente y colóquelo en hielo para usarlo más tarde.
3. Se recomienda realizar cada paso de la reacción en un termociclador con tapa calefactada. El termociclador debe precalentarse a la temperatura establecida antes de su uso.
4. Utilice consumibles sin ARNasa.contaminación y limpieza del área experimental Regularmente. RNAZap de ThermoFisher^MT. Se recomendó un aerosol de eliminación de ácido nucleico de alta eficiencia para eliminar la contaminación por ARNasa.
5. Es muy probable que operaciones inadecuadas causen contaminaciones por aerosoles, lo que afectará la precisión del resultado.Se recomienda el aislamiento físico obligatorio de las regiones de mezcla de la reacción de PCR y de las regiones de ensayo de purificación del producto de PCR. Equipado con equipos como pipetas especializadas para la construcción de bibliotecas.
6. 6. Este producto es solo para uso de investigación.

Ligadura del adaptador

1. Los kits de adaptador largo (adaptador con código de barras) Illumina o MGI y los kits de adaptador corto están disponibles para que los clientes elijan según sus requisitos experimentales.
2. Se recomienda seleccionar adaptadores comerciales de alta calidad. Si se seleccionan adaptadores de fabricación propia, confíe en una empresa con experiencia en la síntesis de cebadores NGS y remarque la necesidad de un control estricto de la contaminación. Además, se recomienda preparar la solución de hibridación de ADN en una mesa de trabajo limpia y utilizar solo un tipo de adaptador cada vez para evitar la contaminación cruzada.
3. Descongele los adaptadores en hielo o a 4 °C; cuando se opera a temperatura ambiente, la temperatura del laboratorio no debe superar los 25 °C para evitar que los adaptadores se desnaturalicen.
4. La concentración del adaptador afecta directamente la eficiencia de la ligación y el rendimiento de la biblioteca. El volumen de adaptador añadido al kit se fija en 5 μl. Se recomienda diluir los adaptadores con tampón TE 0,1× y los adaptadores diluidos se pueden almacenar a 4 °C durante 48 horas. Tabla1 enumera la cantidad de adaptador recomendada para diferentes cantidades de ARN de entrada.

Tabla 1-1 Illumina recomendada^® Cantidad de adaptadores para diferentes entradas ADN y ARN

Tabla 1-2 El MGI recomendado^® Cantidad de adaptadores para diferentes entradas ADN y ARN

*El uso del adaptador se puede ajustar según los diferentes tipos de muestras de ARN total y la cantidad de entrada.

Amplificación de la biblioteca

La cantidad de ciclos de amplificación debe controlarse estrictamente. Una amplificación insuficiente puede generar un bajo rendimiento de la biblioteca; la sobreamplificación puede generar mayor sesgo, errores, lecturas duplicadas y productos quiméricos. Tabla 2 enumera los números de ciclos recomendados que apuntan al rendimiento de la biblioteca de 1 μg.

Mesa 2 Número recomendado de ciclos para generar una biblioteca de ADN y ARN *

Nota: *El rendimiento de la biblioteca no solo está relacionado con la cantidad de entrada y el número de ciclos de amplificación, sino que también se ve afectado por la calidad de las muestras, las condiciones de fragmentación y las condiciones de clasificación. En el proceso de construcción de la biblioteca, elija las condiciones más adecuadas según la situación real.

Limpieza y selección de tamaño de ADN con microesferas

1. 1. Existen varios pasos en el proceso de construcción de la biblioteca que requieren perlas magnéticas para la purificación del ADN. Recomendamos perlas de selección de ADN Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) o perlas magnéticas AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) para la purificación y selección del tamaño del ADN.
2. 2. Las perlas magnéticas deben equilibrarse a temperatura ambiente antes de su uso, de lo contrario, el rendimiento disminuirá y el efecto de selección de tamaño se verá afectado.
3. 3. Las perlas magnéticas deben mezclarse bien mediante vórtex o pipeteo antes de su uso.
4. 4. No aspire las perlas al transferir el sobrenadante; incluso trazas de perlas pueden afectar las siguientes reacciones.
5. 5. El etanol al 80% debe prepararse recién, de lo contrario afectará la eficiencia de recuperación.
6. 6. Las perlas magnéticas deben secarse a temperatura ambiente antes de eluir el producto. Una sequedad insuficiente puede provocar que los residuos de etanol afecten fácilmente las reacciones posteriores; una sequedad excesiva puede provocar que las perlas magnéticas se agrieten y reduzcan el rendimiento de la purificación. Normalmente, un secado a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos es suficiente para permitir que las perlas se sequen por completo.
7. 7. Si es necesario, las muestras de ADN purificadas o de tamaño seleccionado se eluyen en1× El tampón TE se puede almacenar a 4 °C durante 1-2 semanas o a -20 °C durante un mes.

Análisis de calidad de la biblioteca

1. La calidad de las bibliotecas construidas generalmente se analiza midiendo las concentraciones y distribuciones de tamaño.
2. Las concentraciones de las bibliotecas se pueden medir mediante métodos basados ​​en fluorescencia como Qubit y PicoGreen o qPCR.
3. NO se recomienda utilizar métodos de cuantificación basados ​​en absorbancia como NanoDrop.
4. Se recomienda utilizar el método qPCR para la cuantificación de las bibliotecas: los métodos basados ​​en fluorescencia como Qubit y PicoGreen no pueden diferenciar las estructuras de dsADN incompletas (insertos sin adaptador o con solo uno de los extremos ligado con adaptador) de las bibliotecas completas. El método qPCR solo amplificará y medirá las bibliotecas completas con ambos extremos ligados con adaptadores (las bibliotecas secuenciables), lo que proporciona una medición más precisa para la carga.
5. La distribución del tamaño de las bibliotecas se puede analizar utilizando Agilent Bioanalyzer u otros dispositivos basados ​​en los principios de electroforesis capilar o microfluídica.

Otros materiales

1. 1. Perlas magnéticas de purificación de ADN: Perlas de selección de ADN Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) o AMPure^®XP Beads (A63880) u otros productos equivalentes.

2.Adaptadores: Adaptador completo para Illumina (Yeasen Cat#13519-13520 u otros productos equivalentes) o Adaptador completo para MGI (Yeasen Cat#13360-13362 u otros productos equivalentes).

3. Análisis de calidad de la biblioteca: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip u otros productos equivalentes; reactivos cuantitativos de biblioteca.
4. Otros materiales: etanol absoluto, agua ultrapura estéril, puntas de pipeta de baja retención, tubo de PCR, soportes magnéticos, termociclador, etc.

Documentos:

Manuales

12305ES-Kit de preparación conjunta de bibliotecas de ADN y ARN Hieff NGS® V2.pdf