Alto NGS™ One Pot Flash DNA Library PrepKit es un kit de biblioteca de ADN enzimático rápido，bruja Contiene enzimas de alta calidad para la fragmentación del ADN y combina la fragmentación del ADN, la reparación final y la eliminación de dA en un solo paso, lo que reduce significativamente el tiempo y el costo de preparación de la biblioteca.

Este kit de preparación de biblioteca es compatible con muestras de 100 pg a 500 ng de todos los animales, plantas, microorganismos, etc. comunes.

y realizar rápidamente la fragmentación del ADN, la reparación terminal y la reacción de adición de cola A en un solo tubo. El kit debe combinarse con adaptadores y cebadores, y es compatible con Illumina. y MGI Plataformas de secuenciación de alto rendimiento.

Característica

1) Adecuado para muestras de ADN genómico de 100 pg-500 ng.

2）compatible con Illumina y MGI Plataformas de secuenciación de alto rendimiento.

3）Fragmentación, reparación de extremos y colas A reacción dentro 5 minutos

4）Tasa de conversión de biblioteca eficiente y eficiencia de amplificación.

Presupuesto

Componentes

Nota: * indica que este reactivo no está incluido en este kit y se requieren reactivos adicionales.El kit es compatible con plataformas duales de Illumina y MGI, pero mezcla de imprimación adicional (CAT # 13334 Mezcla de imprimación para MGI y se requiere mezcla de primer Cat# 13335 para Illumina).

Almacenamiento

Este producto debe almacenarse a una temperatura entre -25 y -15 °C.℃ para 1 año.

Cifras

Figura 1. Detección de ADN de 10 tipos de microorganismos

Las bibliotecas se prepararon utilizando Gato n.° 12316 protocolo ,10 ng del estándar de ADN de la comunidad microbiana ZymoBIOMICS (Zymo Research® n.° D6306). Las bibliotecas se agruparon y secuenciaron en un Illumina (SE75).Los datos de secuenciación se homogeneizaron a 20M y se comparó la composición esperada y detectada para ambos niveles de entrada. La detección de ADN genómico específico fue consistente con la composición esperada. Composición esperada: Cryptococcus neoformans 2%, Saccharomyces cerevisiae 2%, Bacillus subtilis 12%, Escherichia coli 12%, Enterococcus faecalis 12%, Lactobacillus fermentum 12%, Listeria monocytogenes 12%, Pseudomonas aeruginosa 12%, Staphylococcus aureus 12% y Salmonella enterica 12%.

Sobre la operación

1. Por favor, trabaje con bata de laboratorio y guantes desechables.，Para su seguridad.

2. Descongele los componentes a temperatura ambiente. Después de descongelar, mezclar bien mediante vórtex, girar el tubo brevemente y colocarlo en hielo para su uso posterior.

3. Al preparar la solución de reacción en cada paso, se recomienda utilizar una pipeta para soplar y mezclar uniformemente o agitar suavemente. Una agitación violenta puede hacer que disminuya la producción de la biblioteca.

4. Para evitar la contaminación cruzada de las muestras, se recomienda utilizar un cabezal de pistola con un elemento filtrante. Reemplace el cabezal de pistola cuando absorba diferentes muestras.

5. Se recomienda realizar cada paso de la reacción en un termociclador con tapa calefactada. El termociclador debe precalentarse a la temperatura establecida antes de su uso.

6. Es muy probable que las operaciones inadecuadas provoquen contaminaciones por aerosoles, lo que afectará la precisión del resultado. Se recomienda el aislamiento físico obligatorio de las regiones de mezcla de la reacción de PCR y de las regiones de ensayo de purificación del producto de PCR. Equipado con equipos como pipetas especializadas para la construcción de bibliotecas.

7. Este producto es solo para uso de investigación.

Acerca de la fragmentación del ADN

1. El rango compatible de este kit es de 100 pg.–500 ng de ADN de entrada. Se debe utilizar ADN de entrada de alta calidad con A260/A280 = 1,8-2,0 siempre que sea posible.

2. Si el ADN de entrada contiene una alta concentración de agente quelante de iones metálicos u otras sales, esto puede afectar los experimentos posteriores. Se recomienda diluir el ADN en ddH2O o Tebuffer (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0-8,5; 0,1 mM de EDTA).

3. Para la mayoría del ADN genómico de alta calidad, el tiempo de digestión se muestra en la Tabla 1. El kit tiene baja preferencia y puede tolerar varias plantillas con contenido de GC.

Tabla 1. Tiempo recomendado de fragmentación del ADN genómico convencional

Ligadura del adaptador

1. La concentración del adaptador afecta directamente la eficiencia de la ligadura y el rendimiento de la biblioteca. El uso excesivo de adaptador puede producir más dímero adaptador; la dosis baja puede afectar la ligadura eficiencia y rendimiento de la biblioteca. Las tablas 2 y 3 enumeran la cantidad recomendada de Adaptador para diferentes entradas de ADN utilizando este kit.

Tabla 2. El Illumina recomendado Cantidad de adaptadores para diferentes entradas de ADN

Tabla 3. El MGI recomendado Cantidad de adaptadores para diferentes entradas de ADN

Amplificación de la biblioteca

La cantidad de ciclos de amplificación debe controlarse estrictamente. Una amplificación insuficiente puede generar un bajo rendimiento de la biblioteca; la sobreamplificación puede generar mayor sesgo, errores, lecturas duplicadas y productos quiméricos. Tabla 4 enumera los números de ciclo recomendados que apuntan al rendimiento de la biblioteca de 1 micrasgramo.

Tabla 4. Los ciclos recomendados de 100 pg-500 ng de ADN de entrada

Limpieza y selección de tamaño de ADN con microesferas

1. Existen varios pasos en el proceso de construcción de la biblioteca que requieren perlas magnéticas para purificación de ADN. Recomendamos Hieff NGS™ Perlas de selección de ADN (Yeasen Cat. n.° 12601) o AMPure™ Perlas magnéticas XP (Beckman Cat#A63880) para purificación de ADN y selección de tamaño.

2. Las perlas magnéticas deben equilibrarse a temperatura ambiente antes de su uso, de lo contrario, el rendimiento disminuirá y el efecto de selección de tamaño se verá afectado.

3. Las perlas magnéticas deben mezclarse bien mediante vórtex o pipeteo antes de su uso.

4. No aspire las perlas al transferir el sobrenadante; incluso trazas de perlas pueden afectar las siguientes reacciones.

5. El etanol al 80% debe prepararse recién, de lo contrario afectará la eficiencia de recuperación.

6. Las perlas magnéticas deben secarse a temperatura ambiente antes de eluir el producto. Una sequedad insuficiente puede provocar que los residuos de etanol afecten fácilmente las reacciones posteriores; una sequedad excesiva puede provocar que las perlas magnéticas se agrieten y reduzcan el rendimiento de la purificación. Normalmente, un secado a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos es suficiente para permitir que las perlas se sequen por completo.

7. Si es necesario, las muestras de ADN purificadas o de tamaño seleccionado se eluyen en 0,1× El tampón TE se puede almacenar a 4 °C durante 1-2 semanas o a -20 °C durante un mes.

Análisis de calidad de la biblioteca

1. La calidad de las bibliotecas construidas generalmente se analiza midiendo las concentraciones y distribuciones de tamaño.

2. Las concentraciones de bibliotecas se pueden medir mediante métodos basados ​​en fluorescencia como Qubit y PicoGreen o qPCR.

3. No se recomienda utilizar métodos de cuantificación basados ​​en la absorbancia como NanoDrop.

4. Se recomienda utilizar el método qPCR para cuantificar las bibliotecas: los métodos basados ​​en fluorescencia como Qubit y PicoGreen no pueden diferenciar las estructuras de dsADN incompletas (insertos sin adaptador o con solo uno de los extremos ligado con adaptador) de las bibliotecas completas. El método qPCR solo amplificará y medirá las bibliotecas completas con ambos extremos ligados con adaptadores (las bibliotecas secuenciables), lo que proporciona una medición más precisa para la carga.

5. La distribución del tamaño de las bibliotecas se puede analizar utilizando Agilent Bioanalyzer u otros dispositivos basados ​​en los principios de electroforesis capilar o microfluídica.

Documentos:

Hoja de datos de seguridad

12316_Ficha de datos de seguridad_HB250211_ES.PDF

Manuales

12316_Manual_Versión Enorte20241225.pdf