Alto NGS^MT. El kit de preparación de biblioteca de ARN EvoMax (dUTP) es un premezclado, actinomicina D libre y específico de la hebra total Biblioteca de secuenciación de ARN deberes Kit compatible con las plataformas Illumina y MGI. Este producto está disponible en dos tipos: tubo o kit de sellado, y Este kit es más conveniente ya sea mediante dispositivo automatizado de manipulación de líquidos o manipulación manual El kit contiene reactivos de fragmentación de ARN, reactivos de transcripción inversa, reactivos de síntesis de ds-cDNA específicos de cadena y reactivos de amplificación de biblioteca. Se puede combinar con el kit de purificación de ARNm o el kit de eliminación de ARNr para Realice investigaciones sobre ARNm o ARNm no codificante. Este producto optimiza el módulo de transcripción inversa para obtener una biblioteca de alta especificidad de cadena sin actinomicina D, lo que garantiza en mayor medida la seguridad de los experimentadores. Todos los reactivos se sometieron a un estricto control de calidad y validación funcional para maximizar la estabilidad y repetibilidad de la biblioteca. preparación.

Presupuesto

Componentes

Nota: * La notación indica que el componente no está incluido en el kit. Se requiere una mezcla de imprimación si se utilizan los adaptadores completos, de lo contrario no se incluye.'t. Este kit es compatible con las plataformas Illumina y MGI, pero necesita una mezcla de cebadores adicional (Cat. n.° 13334 Mezcla de cebadores para MGI)^MT. y Cat # 13335 Primer Mix para Illumina®) para la plataforma Illumina® o MGI si se utilizan los adaptadores completos.

Cifra

La disposición del grupo de reactivos de placa.

Figura 1: disposición de reactivos del kit de biblioteca de placas de sellado

Figura 2. Componentes simplificados de Kit de preparación de biblioteca de ARN EvoMax.

Almacenamiento

Este producto debe almacenarse a -25~-15℃ durante 1 años.

Instrucciones

1. La cantidad recomendada para agregar en un sistema de 20 μL es 0,1-1 unidades (U), y la cantidad de entrada se puede ajustar en función de los resultados reales.

2. Según las demandas del experimento, la concentración final de dUTP se puede ajustar entre 0,2~0,6 mM, y se puede agregar selectivamente 0,2 mM de dTTP.

3. El tiempo de reacción a 25~37℃ Se puede ajustar entre 5 y 10 minutos según los requisitos experimentales.

Notas

1. Operación

1) Por favor trabajar con bata de laboratorio y guantes desechables.，Para tu seguridad.

2) Descongele los componentes a temperatura ambiente. Mezcle bien invirtiéndolos varias veces, centrifugue brevemente y coloque en hielo para su uso.

3) Se recomienda realizar cada paso de la reacción en un termociclador con tapa calefactada. El termociclador debe precalentarse a la temperatura establecida antes de su uso.

4) Es necesario contar con suministros libres de contaminación por ARNasa y limpiar el área experimental con regularidad. RNAZap de ThermoFisher^MT. Se recomendó un aerosol de eliminación de ácido nucleico de alta eficiencia para eliminar la contaminación por ARNasa.

5) Es muy probable que las operaciones inadecuadas provoquen contaminaciones por aerosoles, lo que afectará la precisión del resultado. Se recomienda el aislamiento físico obligatorio de las regiones de mezcla de la reacción de PCR y de las regiones de ensayo de purificación del producto de PCR. Equipado con equipos como pipetas especializadas para la construcción de bibliotecas.

6) Este reactivo es para un solo uso. Está estrictamente prohibido su uso múltiple.

7) Este producto es solo para uso de investigación.

2. Ligadura del adaptador

1) Los kits de adaptador largo (adaptador con código de barras) Illumina o MGI y los kits de adaptador corto están disponibles para que los clientes elijan según sus requisitos experimentales.

2) Se recomienda seleccionar adaptadores comerciales de alta calidad. Si se seleccionan adaptadores de fabricación propia, confíe en una empresa con experiencia en la síntesis de cebadores NGS y remarque la necesidad de un control estricto de la contaminación. Además, se recomienda preparar la solución de hibridación de ADN en una mesa de trabajo limpia y utilizar solo un tipo de adaptador cada vez para evitar la contaminación cruzada.

3) Descongele los adaptadores en hielo o a 4 °C; cuando se opera a temperatura ambiente, la temperatura del laboratorio no debe superar los 25 °C para evitar que los adaptadores se desnaturalicen.

4) La concentración del adaptador afecta directamente la eficiencia de la ligadura y el rendimiento de la biblioteca. El volumen de adaptador añadido al kit está fijado en 5 μl. Se recomienda diluir los adaptadores con tampón TE 0,1× y los adaptadores diluidos se pueden almacenar a 4 °C durante 48 horas. Tabla 1 enumera la cantidad de adaptador recomendada para diferentes cantidades de ARN de entrada.

Tabla 1-1 Cantidad recomendada de adaptador Illumina para diferentes ARN de entrada

Tabla 1-2 Cantidad recomendada de adaptador MGI para diferentes ARN de entrada

* El uso del adaptador se puede ajustar según los diferentes tipos de muestras de ARN total y la cantidad de entrada.

3.Amplificación de la biblioteca

1) Sobre la base de la ADN polimerasa de primera generación, la ADN polimerasa de alta fidelidad del kit ha mejorado enormemente su uniformidad de amplificación y no presenta sesgo de amplificación.

2) El número de ciclos de amplificación debe controlarse estrictamente. Una amplificación insuficiente puede dar lugar a un bajo rendimiento de la biblioteca; la sobreamplificación puede generar mayor sesgo, errores, lecturas duplicadas, productos quiméricos y acumulación de mutaciones de expansión. En la Tabla 2 se enumeran los números de ciclos recomendados para la amplificación por PCR.

3) La cantidad de ciclos recomendada en la Tabla 2 puede satisfacer la gran mayoría de los requisitos de preparación de la biblioteca. Si la muestra es de mala calidad (como muestras FFPE con degradación grave), la cantidad de ciclos se puede aumentar de manera adecuada, según la situación real. Preste atención a que el ARNm varía según las diferentes especies y tejidos, por lo que se debe ajustar la cantidad de ciclos de amplificación.

Tabla 2 Volumen total de ARN de entrada y ciclos de amplificación recomendados Tabla *

[Nota]: *El rendimiento de la biblioteca no solo está relacionado con la cantidad de entrada y el número de ciclos de amplificación, sino que también se ve afectado por la calidad de las muestras, las condiciones de fragmentación y las condiciones de clasificación. En el proceso de construcción de la biblioteca, elija las condiciones más adecuadas según la situación real.

4. Limpieza y selección del tamaño del ADN con microesferas

1) Existen varios pasos en el proceso de construcción de la biblioteca que requieren perlas magnéticas para la purificación del ADN. Recomendamos perlas de selección de ADN Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) o perlas magnéticas AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) para la purificación y selección del tamaño del ADN.

2) La perla magnética debe equilibrarse a temperatura ambiente antes de su uso, de lo contrario El rendimiento disminuirá y el efecto de selección de tamaño se verá afectado.

3) Las perlas magnéticas deben mezclarse bien mediante vórtex o pipeteo antes de su uso.

4) No aspire las perlas al transferir el sobrenadante; incluso trazas de perlas pueden afectar las siguientes reacciones.

5) El etanol al 80% debe prepararse recién, de lo contrario afectará la eficiencia de recuperación.

6) Las perlas magnéticas deben secarse a temperatura ambiente antes de eluir el producto. Una sequedad insuficiente puede provocar que los residuos de etanol afecten fácilmente las reacciones posteriores; una sequedad excesiva puede provocar que las perlas magnéticas se agrieten y reduzcan el rendimiento de la purificación. Normalmente, un secado a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos es suficiente para permitir que las perlas se sequen por completo.

7) Si es necesario, las muestras de ADN purificadas o de tamaño seleccionado eluidas en tampón TE se pueden almacenar a 4 °C durante 1-2 semanas o a -20 °C durante un mes.

5.Análisis de calidad de la biblioteca

Generalmente, la calidad de la biblioteca construida se puede evaluar mediante la detección de concentración y la detección de distribución de longitud.

6. Otros materiales

1) Kit de enriquecimiento de ARNm: Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit V2 (Yeasen Cat # 12629).

2) Kit de eliminación de ARNr: Kit de depleción de ARNr humano Hieff NGS® MaxUp (ARNr e ITS/ETS) (Yeasen Cat # 12257) u otro kit de eliminación de ARNr.

3) Purificación de ARN de perlas magnéticas: Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen Cat # 12602) u otros productos equivalentes.

4) Perlas magnéticas purificadas de ADN: Perlas de selección de ADN Hieff NGS® (Yeasen Cat # 12601) o Perlas AMPure® XP (A63880) u otros productos equivalentes.

5) Control de calidad de ARN: Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano / Pico Chip u otros productos equivalentes.

6) Adaptadores: Adaptador completo para uso con Illumina® (Cat. n.° 13519-13520 u otro equivalente) o Adaptador completo para uso con MGI® (Cat. n.° 13360-13362 u otro equivalente).

7. Inspección de calidad de la biblioteca

Chip Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 / Chip de alta sensibilidad u otros productos equivalentes; reactivos de cuantificación de bibliotecas.

8. Otros materiales

Etanol anhidro, agua ultrapura estéril, cabezal de pistola de baja adsorción, tubo de PCR, marco magnético, instrumento de PCR, etc.

Diagrama de flujo

Figura 1: Proceso de construcción de la biblioteca de ARN

Preparación de la biblioteca de ARN para muestras FFPE de diferente calidad

Para ARN FFPE severamente degradado (DV 200 <50%) y muestras de entrada bajas, recomendamos un protocolo de doble purificación después de la ligadura del adaptador para reducir la pérdida de biblioteca.

Patrones de picos de muestras de FFPE de diferente calidad