El Hieff NGS™ OnePot Pro DNA Library Prep Kit V4 es un kit de preparación de biblioteca enzimática de última generación diseñado para usar con Illumina y plataformas de secuenciación de alto rendimiento MGI. En comparación con los métodos tradicionales de preparación de bibliotecas, este kit utiliza enzimas de fragmentación de alta calidad, lo que elimina la necesidad de procesos de sonicación engorrosos. Los módulos de fragmentación y reparación de extremos se combinan en un solo paso, lo que reduce significativamente tanto el tiempo como el costo de la preparación de la biblioteca. Este kit es adecuado para una amplia gama de tipos de muestras, incluidos genomas de plantas y animales, genomas microbianos y más, con un rango de entrada de muestra de 1 ng a 1 μg. La fragmentación enzimática garantiza tamaños de fragmentos uniformes en diferentes especies, con una variación mínima entre especies. Además, este kit se puede combinar con Illumina o MGI Adaptadores y cebadores para secuenciación en plataformas de alto rendimiento Illumina o MGI.

Presupuesto

Componentes

Almacenamiento

Este producto debe almacenarse a -25~-15℃ durante 1 año.

Notas

1. Sobre la operación

1. Por favor, trabaje con bata de laboratorio y guantes desechables.，Para su seguridad.

2. Descongele los componentes a temperatura ambiente. Después de descongelar, mezclar bien mediante vórtex, girar el tubo brevemente y colocarlo en hielo para su uso posterior.

3. Al preparar la solución de reacción de cada paso, se recomienda utilizar una pipeta para mezclar bien o agitar suavemente. Una agitación vigorosa puede provocar una disminución en la producción de la biblioteca.

4. Se recomienda encarecidamente utilizar puntas de pipeta con filtro para evitar la contaminación cruzada. Asegúrese de cambiar las puntas de pipeta cuando procese distintas muestras.

5. Es muy probable que las operaciones inadecuadas provoquen contaminaciones por aerosoles, lo que afectará la precisión del resultado. Se recomienda el aislamiento físico obligatorio de las regiones de mezcla de la reacción de PCR y de las regiones de ensayo de purificación del producto de PCR. Equipado con equipos como pipetas especializadas para la construcción de bibliotecas.Realice una limpieza de rutina para cada área limpiando las superficies con hipoclorito de sodio al 0,5% o blanqueador al 10%.

6. Este producto es solo para uso de investigación.

1. El kit es compatible con 100 pg - 1000 ng de ADN de entrada. Se recomienda encarecidamente utilizar ADN de entrada de alta calidad con A260/A280 = 1,8-2,0.

2. Los experimentos siguientes podrían verse afectados si se introdujeran altas concentraciones de sales como el agente quelante de metales con el ADN de entrada. Recomendamos eluir la muestra de ADN en DdH₂Oh para la fragmentación.

3. Consulte la tabla 6 para el tiempo de fragmentación de muestras de ADN estándar.El kit tiene un bajo sesgo de fragmentación y proporciona una cobertura de GC uniforme para muestras de ADN con una amplia gama de composiciones de GC. Ajuste el tiempo de fragmentación según sus requisitos experimentales.

4. Para una fragmentación precisa, prepare la reacción en hielo.

3. Ligadura del adaptador

1. Los kits de adaptador largo (adaptador con código de barras) Illumina o MGI y los kits de adaptador corto están disponibles para que los clientes elijan según sus requisitos experimentales.

2. Se recomienda seleccionar adaptadores comerciales de alta calidad. Si se seleccionan adaptadores de fabricación propia, confíe en una empresa con experiencia en la síntesis de cebadores NGS y remarque la necesidad de un control estricto de la contaminación. Además, se recomienda preparar la solución de hibridación de ADN en una mesa de trabajo limpia y utilizar solo un tipo de adaptador cada vez para evitar la contaminación cruzada.

3. Descongele los adaptadores en hielo o a 4 °C; cuando se opera a temperatura ambiente, la temperatura del laboratorio no debe superar los 25 °C para evitar que los adaptadores se desnaturalicen.

4. La calidad y concentración de los adaptadores afectarán directamente la eficiencia de la ligadura y el rendimiento de la biblioteca. Una concentración demasiado alta de adaptadores favorece la formación de dímeros de adaptadores, mientras que una concentración demasiado baja de adaptadores reduce la tasa de ligadura y el rendimiento de la biblioteca. Diluciones correspondientes con tampón TE según la cantidad de ADN de entrada cuando se utiliza el adaptador. Tabla 2 -3 enumera los métodos de dilución del adaptador recomendados para diferentes cantidades de ADN de entrada utilizando este kit.

Tabla 1 La cantidad recomendada de adaptador Illumina para diferentes ADN de entrada

Tabla 2 La cantidad de adaptador MGI recomendada para diferentes ADN de entrada

4. Limpieza y selección de tamaño de ADN con microesferas

1. El paso de selección del tamaño del fragmento de ADN se puede realizar después de la ligadura del adaptador o después de la amplificación de la biblioteca.

2. Se recomienda realizar la selección de tamaño inmediatamente después de la ligadura del adaptador si la cantidad de ADN de entrada es superior a 50 ng.; De lo contrario, realice la selección de tamaño después de la amplificación.

3. El potenciador de ligadura contiene una alta concentración de PEG, lo que puede causar un impacto significativo en la selección precisa del tamaño. Por lo tanto, si la selección del tamaño se va a realizar inmediatamente después de la ligadura del adaptador, se recomienda encarecidamente agregar un paso de limpieza de perlas antes de la selección del tamaño. El paso de selección del tamaño se puede realizar directamente si se realiza antes de la reparación final/cola de dA o después La amplificación de la biblioteca.

4. Las perlas magnéticas deben equilibrarse a temperatura ambiente antes de su uso, de lo contrario, el rendimiento disminuirá y el efecto de selección de tamaño se verá afectado.

5. Las perlas magnéticas deben mezclarse bien mediante vórtex o pipeteo antes de su uso.

6. No aspire las perlas al transferir el sobrenadante; incluso trazas de perlas pueden afectar las siguientes reacciones.

7. El etanol al 80% debe prepararse recién, de lo contrario afectará la eficiencia de recuperación.

8. Para una selección precisa del tamaño, se recomienda comenzar con un volumen de más de 100 μL. Si es menor, se recomienda aumentar el volumen hasta 100 μL con agua ultrapura.

9. Las perlas magnéticas deben secarse a temperatura ambiente antes de eluir el producto. Una sequedad insuficiente puede provocar que los residuos de etanol afecten fácilmente las reacciones posteriores; una sequedad excesiva puede provocar que las perlas magnéticas se agrieten y reduzcan el rendimiento de la purificación. Normalmente, un secado a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos es suficiente para permitir que las perlas se sequen por completo.

10. Si es necesario, las muestras de ADN purificadas o de tamaño seleccionado se eluyen en 0,1× El tampón TE se puede almacenar a 4 °C durante 1-2 semanas o a -20 °C durante un mes.

5. Amplificación de la biblioteca

1. La realización o no de la amplificación de la biblioteca depende de la cantidad de ADN de entrada, los tipos de adaptadores, las aplicaciones de los datos de secuenciación, etc. El paso de amplificación es necesario si se utilizan adaptadores parciales. Cuando se utilizan adaptadores de longitud completa, si el ADN de entrada es <200 ng, se recomienda realizar la amplificación; de lo contrario, no es necesaria.

2. La cantidad de ciclos de amplificación debe controlarse estrictamente. Una amplificación insuficiente puede generar un bajo rendimiento de la biblioteca; la sobreamplificación puede generar mayor sesgo, errores, lecturas duplicadas y productos quiméricos. Tabla 3 enumera los números de ciclos recomendados que apuntan al rendimiento de la biblioteca de 1 μg.

Tabla 3 Número recomendado de ciclos para generar 1.000 ng de rendimiento de la biblioteca

Nota:

1.Tabla 3 muestra la cantidad de parámetros de bucle utilizando pruebas de ADN de entrada de alta calidad de alrededor de 200 pb. La calidad del ADN FFPE varía mucho y, cuando la calidad del ADN es deficiente o la longitud de la biblioteca es larga, es necesario aumentar adecuadamente la cantidad de ciclos para obtener bibliotecas suficientes.

2.ISi se requiere la selección del tamaño durante el proceso de construcción de la biblioteca, se recomienda un número de ciclo más alto para la amplificación de la biblioteca; de lo contrario, se recomienda un número de ciclo más bajo.

3.ISi se utilizan adaptadores incompletos, es necesario amplificar al menos 2 ciclos para formar un adaptador completo.

6. Análisis de la calidad de la biblioteca

1. La calidad de las bibliotecas construidas generalmente se analiza midiendo las concentraciones y distribuciones de tamaño.

2. Las concentraciones de las bibliotecas se pueden medir mediante métodos basados ​​en fluorescencia como Qubit y PicoGreen o qPCR.

3. NO se recomienda utilizar métodos de cuantificación basados ​​en absorbancia como NanoDrop.

4. Se recomienda utilizar el método qPCR para cuantificar las bibliotecas: los métodos basados ​​en fluorescencia como Qubit y PicoGreen no pueden diferenciar las estructuras de dsADN incompletas (insertos sin adaptador o con solo uno de los extremos ligado con adaptador) de las bibliotecas completas. El método qPCR solo amplificará y medirá las bibliotecas completas con ambos extremos ligados con adaptadores (las bibliotecas secuenciables), lo que proporciona una medición más precisa para la carga.

5. La distribución del tamaño de las bibliotecas se puede analizar utilizando Agilent Bioanalyzer u otros dispositivos basados ​​en los principios de electroforesis capilar o microfluídica.

7. Otros materiales

1. Perlas magnéticas para purificación de ADN: Hieff NGS^MT. Perlas de selección de ADN (Yeasen Cat. n.° 12601) o AMPure^® XP Beads (A63880) u otros productos equivalentes.

2. Adaptadores: Adaptador completo para Illumina: Yeasen Cat#13519-13520; 384 Cebadores CDI dobles:Yeasen Gato n.° 12412 ~ Gato n.° 12413; 384 cebadores de índice dual único (UDI): Yeasen Gato n.° 12327~Gato #13330; Adaptadores UMI UDI:Yeasen Gato n.° 13370 ~ Gato n.° 13371; Adaptador completo para MGI: Yeasen Cat#13360-13362. Mezcla de cebadores de ADN:Gato#12190 o Gato#12191.

3. Análisis de calidad de la biblioteca: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip u otros productos equivalentes; reactivos cuantitativos de biblioteca.

4. Otros materiales: etanol absoluto, agua ultrapura estéril, puntas de pipeta de baja retención, tubo de PCR, soportes magnéticos, termociclador, etc.

8. Flujo de trabajo

Figura 1.El flujo de trabajo de Una olla Pro ADN Kit de preparación para la biblioteca