Hifair™ Kit de sonda RT-qPCR de un solo paso V Multiplex (Universidad de Georgia Más) es un kit de PCR cuantitativa multiplex basado en ARN como plantilla. En el proceso del experimento, la transcripción inversa y la PCR cuantitativa se llevaron a cabo en el mismo tubo, lo que simplificó la operación experimental y redujo el riesgo de contaminación.

En este kit, el ADNc de primera cadena se sintetizó de manera eficiente mediante Hifair resistente al calor.^MT. V Transcriptasa inversa y amplificada cuantitativamente por UNICON^MT. Polimerasa de ADN Taq HotStart. El kit contiene principalmente un tampón MP optimizado, una mezcla de enzimas, etc. La solución tampón ya contiene Mg²⁺ y dNTP. Además, se añaden los factores que pueden inhibir eficazmente la amplificación por PCR no específica y mejorar la eficiencia de amplificación de múltiples reacciones de qPCR, lo que puede garantizar la eficiencia de la amplificación y llevar a cabo hasta múltiples reacciones de amplificación. Se añadió el sistema dUTP/UDG para prevenir eficazmente el riesgo de contaminación por aerosoles.

Características

Alta sensibilidad:El sistema de tampón cuidadosamente optimizado mejora la sensibilidad de detección de plantillas de baja concentración hasta 250 copias/ml.；

Súper estabilidad: El producto ha pasado pruebas de estabilidad en tiempo real durante 18 meses.

Sistema anticontaminación dUP/UDG:Se introduce el sistema anticontaminación dUTP/UDG para degradar eficazmente la contaminación por aerosoles de los productos, reducir los falsos positivos y garantizar resultados auténticos.；

Admite programa rápido: compatible con programa rápido, 40 minutos pueden producir resultados;

Componentes

Nota: 1) 2×Hifair^MT. Búfer V MP es la abreviatura de Hola feriado^MT. Tampón de sonda RT-qPCR de un solo paso V Multiplex, que incluye dNTP, dUTP, Mg2+, estabilizadores, potenciadores y más.

2) Hola feriado^MT. Mezcla de enzimas V contiene principalmente Hifair resistente al calor^MT. V transcriptasa inversa, UNICONMT. Polímeros de ADN HotStart Taq y Base de datos UDGase.

Almacenamiento

yoél producto debería ser almacenado en -25 °C ~ -15 °C para 18 meses.

Instrucciones

Composición de la reacción

Nota:Asegúrese de mezclar bien antes de usar, evite burbujas excesivas causadas por vibraciones violentas.

a) Imprimación/Sonda concentración: Cebador mezcla que incluye primer multiplex, Dependiendo de la situación, la concentración óptima de cebador puede estar entre 0,1 y 1,0 μM.Mezcla de sondas que incluye grupo fluorescente de diferencia de etiquetado de sonda multiplex, dependiendo de la situación la concentración óptima de sonda puede estar entre 0,05 y 0.5 micras.

c) Dilución del molde: la PCR cuantitativa es muy sensible y se recomienda diluir el molde. El valor Ct del control es adecuado entre 20 y 35.

d) Preparación del sistema: quitar el cabezal del elemento filtrante. Evitar la contaminación cruzada y la contaminación por aerosoles.

Protocolo de ciclismo optimizado

Nota:a) Rtranscripción inversa: La temperatura se puede seleccionar 42°C o 50°C durante 10-15 minutos.

b) Reacción de amplificación: La temperatura se ajusta según el valor de Tm de los cebadores diseñados.

do) Adquisición de señales de fluorescencia:Configure el procedimiento experimental de acuerdo con los requisitos del manual del instrumento.

3. Solicitud equipo

Equipamiento con Rox:ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Rápido, StepOne™, StepOne Plus™

Equipo con Low Rox:ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 y 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex

Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™

Equipo sin Rox:

Bio-Ray CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™

Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000 de Corbett

Roche Ciencia Aplicada LightCycler® 480, LightCycler® 2.0, Lightcycler® 96

Termo Ciclador científico PikoReal; Cefeida Ciclistas inteligentes; Ilumina PCR cuantitativa ecológica

Notas

Utilice el EPP necesario, como bata de laboratorio y guantes, para garantizar su salud y seguridad.！

Utilice consumibles libres de ARNasa para El experimento.

Prueba de sensibilidad

Los 13650 almacenados a -20 °C durante 18 meses (grupo experimental) y aquellos dentro del período de vida útil (grupo de control) se analizaron simultáneamente para la dilución en gradiente (500 copias/ml, 250 copias/ml) del pseudovirus SARS-CoV-2, dirigido al gen ORF y al gen N. Se analizaron ocho pocillos replicados para cada concentración, con una tasa de detección del 100%. Además, no hubo diferencias significativas en las formas de los picos de la curva de amplificación y los valores Ct.

Prueba de estabilidad en tiempo real

Los 13650 conservados a -20 °C durante 18 meses y los que se encontraban dentro de su fecha de caducidad. Ambos grupos fueron analizados simultáneamente para el gen ORF del pseudovirus SARS-CoV-2 y el gen N a una concentración de 1000 copias/ml con 20 pocillos replicados. La tasa de detección para ambos fue del 100% y no hubo diferencias significativas en la forma de las curvas de amplificación ni en los valores Ct.

Figura 1. Rescrito: 13650 dentro de su vida útil；azul:13650 almacenado a -20°C durante 18 meses。

Rendimiento estable después de repetidos ciclos de congelación y descongelación.

Al someter el reactivo 13650 a 30 y 50 ciclos de congelación-descongelación utilizando hielo seco, junto con reactivos almacenados normalmente a -20 °C, y probar simultáneamente el gen ORF del pseudovirus SARS-CoV-2, los resultados indicaron que el rendimiento del reactivo 13650 no se vio afectado después de 50 ciclos de congelación-descongelación.

Figura 2. Rojo: 13650 almacenado normalmente a -20 °C; Púrpura:13650 a 30 ciclos de congelación y descongelación；Verde:13650 a 50 ciclos de congelación-descongelación.

Compatible con protocolos estándar y rápidos

Utilizando 13650ES, se detectaron el gen ORF y el gen N del pseudovirus SARS-CoV-2 bajo el mismo sistema de reacción con protocolos estándar y rápidos. Los resultados mostraron que bajo un sistema de 4-plex, no hubo diferencia en las formas de los picos de la curva de amplificación y los valores Ct entre los dos protocolos.

Documentos:

Manuales