El kit está equipado con un potente tampón de lisis, que puede lisar rápidamente muestras (por ejemplo, células, cola de ratón, oreja de ratón, dedo del pie de ratón, músculo, etc.) para liberar ADN genómico, y el lisado se puede agregar directamente al sistema de reacción de PCR sin purificación, lo que es conveniente para la operación. Además, este kit requiere una entrada de muestra baja, se pueden usar 5 mg de tejido de ratón o 1-5 mm de cola de ratón para experimentos.

Componentes

Almacenamiento

19697-A (Solución de lisis) debe almacenarse a 2~8℃ para 1 años. Si se usa varias veces, congélelo en paquetes separados para evitar la contaminación cruzada. 19687-B (Solución de parada) debe almacenarse en -25~-16℃ para 1 años.

Instrucciones

Liberación de ADN genómico de ratón

1. Coloque de 5 a 10 mg de tejido animal o de 1 a 5 mm de cola de ratón en un tubo de centrífuga de 1,5 ml*.
2. Agregue 90 μL de Buffer ML al tubo de centrífuga anterior, agite suavemente para infiltrar completamente la muestra con el lisado y centrifugue brevemente.
3. Incubar a 95°C durante 15 minutos en una incubadora termostática**.
4. Agregue 10 μL de Buffer MT, agite para mezclar y finalice la lisis.
5. Paso opcional: centrifugación a 12000 rpm durante 2 min.
6. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga y guárdelo a 4 °C o -20 °C o tome el sobrenadante directamente para la posterior amplificación por PCR.

* Se debe cortar el tejido tanto como sea posible para permitir que la reacción de lisis se desarrolle con mayor fluidez.

**La incubación a 95 °C durante 15 minutos suele ser suficiente para la mayoría de las necesidades de PCR. Si se necesita una mayor cantidad de ADN o la muestra es difícil de lisar, el tiempo se puede extender a 30 minutos. No es necesario lisar por completo el bloque de tejido y el residuo se puede eliminar en un paso de centrifugación posterior.

Liberación de ADN genómico celular

Después de cultivar las células transfectadas en una placa de 48 pocillos durante 3 días y alcanzar una densidad celular de aproximadamente 70.000 células/pocillo, retire el medio lo más completamente posible. Luego agregue 90 ul de tampón ML directamente por pocillo y pipetee cada pocillo. Transfiera todo a la placa de PCR de 96 pocillos. Después de tratar con una máquina de PCR a 95 °C durante 5-15 minutos y enfriar, agregue 10 ul de tampón MT y sople de manera uniforme y completa. Usando una enzima de alta fidelidad (Cat# 10164) o enzima Taq, agregue 0,5-2 ul de lisado celular a cada 50 ul del sistema de reacción de PCR y realice la PCR.

Figura 1. PCR directa con lisado celular tratado con 19697.

Notas

1. Este producto es solo para uso de investigación.
2. Por favor, trabaje con gafas protectoras, bata de laboratorio y guantes desechables para su seguridad.
3. Para evitar la contaminación cruzada entre muestras, es necesario sumergir el borde del dispositivo de muestreo o la parte en contacto directo con la muestra en una solución de hipoclorito de sodio al 2% después de cada muestreo, lavarlo varias veces y luego secar el líquido residual con una toalla de papel limpia antes de volver a usarlo.Para facilitar la prueba, se pueden preparar varios dispositivos de muestreo y limpiarlos de manera uniforme después de su uso para garantizar que cada muestra individual se muestree con un dispositivo de muestreo libre de contaminación.
4. Se recomienda utilizar tejidos animales recién extraídos. En el caso de tejidos congelados durante mucho tiempo, se debe evitar en la medida de lo posible la congelación y descongelación repetidas, ya que de lo contrario provocará la degradación de la plantilla y afectará la eficiencia de la PCR.

Documentos:

Manuales