La amplificación inespecífica de la ADN polimerasa Taq es un problema común en los experimentos de PCR, que afecta directamente la interpretación de los resultados de detección y puede conducir a una disminución de la sensibilidad de amplificación e incluso a una reducción del rendimiento del fragmento objetivo. El uso de modificadores enzimáticos para sellar el centro activo de la ADN polimerasa Taq a temperatura ambiente, inhibiendo así la actividad de la ADN polimerasa de la enzima Taq a temperatura ambiente, es actualmente el método más eficaz para suprimir la amplificación inespecífica. Los anticuerpos de sellado dual desarrollados por Yisheng no solo sellan la actividad de la polimerasa de la ADN polimerasa Taq, sino que también sellan simultáneamente la actividad de la exonucleasa de la ADN polimerasa Taq. Este enfoque dual previene eficazmente la amplificación inespecífica causada por errores de apareamiento o dímeros de cebadores y también previene la generación de señales inespecíficas debido a la degradación del material, mejorando así doblemente la especificidad del reactivo. Esto permite que los reactivos de detección se adapten al transporte o al uso a temperatura ambiente con facilidad.

1.Especificidad de amplificación ultra alta: el anticuerpo de doble sellado puede sellar simultáneamente las actividades de la polimerasa y la exonucleasa, evitando eficazmente la amplificación no específica y mejorando la especificidad.

2.Sensibilidad de detección excepcional: la formulación de inicio en caliente garantiza una detección eficaz de genes de baja abundancia, ofreciendo una mayor sensibilidad.

3.Excelente estabilidad del producto: rendimiento estable cuando se coloca a 37 °C durante 5 días o a 4 °C durante 10 días.

4.Estabilidad de la línea base y buena linealidad: se aborda el problema de la desviación de la línea base, lo que da como resultado una excelente linealidad.

5.Liberación rápida de la actividad enzimática: más del 95 % de la actividad enzimática se puede liberar calentando a 95 °C durante 20 segundos.

6.Amplia aplicabilidad de enzimas: adecuado tanto para enzimas Taq de tipo salvaje como mutantes, y cada mg de anticuerpo es capaz de sellar entre 4 y 10 KU de enzima Taq.

1 Bloqueo de la actividad exonucleasa de la ADN polimerasa Taq

Las sondas iniciadoras sintéticas se incorporaron respectivamente a las mezclas de reacción de la ADN polimerasa Taq que estaban abiertas o selladas con anticuerpos de doble cierre, y las reacciones se llevaron a cabo a 40 °C. Se detectaron las señales de fluorescencia de ambas y se descubrió que los anticuerpos de doble cierre pueden sellar eficazmente la actividad exonucleasa de la ADN polimerasa Taq.

Figura 2. Detección de la eficiencia de sellado de la actividad endonucleasa-anticuerpo de doble sellado.

02 Verificación de la sensibilidad de detección

Utilizando respectivamente el anticuerpo doblemente sellado de Yeasen y el anticuerpo de T Company para sellar la enzima Taq, seguido de la detección de muestras positivas a través de la tecnología ARMS-PCR, se encontró que la enzima Taq sellada por el anticuerpo doblemente sellado de Yeasen era precisa en la amplificación ARMS-PCR con mayor sensibilidad.

Rojo: Anticuerpo YEASEN+Taq; Azul: proveedor A anticuerpo + Taq.

Figura 3. Curva de amplificación de ARMS-PCR.

03 Verificación de estabilidad (4°C durante 10 días, 37°C durante 5 días).

Utilizando anticuerpos cerrados tradicionales y anticuerpos doblemente cerrados para bloquear respectivamente la ADN polimerasa Taq, la polimerasa se formula luego en una solución de premezcla completa que contiene cebadores y sondas. Esta solución se deja a 4 °C durante 10 días o a 37 °C durante 1, 3 y 5 días, y luego se utiliza para amplificar 10 000 copias del plásmido ASF. Se observó que no hubo cambios significativos en las curvas de amplificación y los valores de Ct.

Figura 4. Curvas de amplificación de 10.000 copias del plásmido ASF después de bloquear la polimerasa Taq con el anticuerpo de bloqueo tradicional (A) y el anticuerpo de doble bloqueo (B), amplificadas mediante el sistema de qPCR..

04 Detección de línea base

En determinadas condiciones en las que se utilizan iniciadores específicos junto con tampones e instrumentos particulares, puede producirse un fenómeno conocido como deriva de la línea base. Sin embargo, el uso de anticuerpos doblemente cerrados puede abordar eficazmente el problema de la deriva de la línea base, facilitando así una línea base más estable.

Figura 5. Curvas de amplificación del gen N del SARS-CoV-2 (A) y del gen ACT (B) en el análisis de qPCR.

05 Verificación de linealidad

La mezcla de reacción sellada con anticuerpos de doble cierre se utilizó para amplificar 100 000, 10 000, 1 000 y 100 copias del plásmido dual ASFV/ACT para generar una curva estándar. Como se puede ver en la Figura 7, ambos muestran una buena linealidad.

Figura 6. Gráficos de curva estándar para el gen ASFV y el gen ACT generados utilizando una mezcla de reacción de doble bloque.

06 Ensayo de liberación de actividad enzimática

Utilizando los anticuerpos de doble cierre (Cat#31303) de Yeasen para sellar la enzima Taq y sometiéndola a un choque térmico a 95°C durante 20 segundos, se detectó la actividad enzimática. Se puede observar que después de un choque térmico de 20 segundos a 95°C, 31303 puede liberar más del 95% de la actividad enzimática, lo que es comparable a los anticuerpos de la Compañía T.

Tabla 1. Choque térmico a 95°C durante 20 segundos de la enzima.

07 Detección de polimerasa Taq multiplex

Los anticuerpos de doble cierre de Yeasen (Cat#31303) se utilizaron para sellar tres tipos de polimerasas Taq (tipo salvaje + dos tipos mutantes), con una relación de sellado de 1 μg a 5 U, y se midieron los valores de fluorescencia y la eficiencia de sellado. Se descubrió que para diferentes tipos de polimerasas Taq, los anticuerpos de doble cierre de Yeasen (Cat#31303) exhibieron buenos efectos de sellado.

Tabla 2. Eficiencia de bloqueo de diferentes tipos de Taq polimerasa.