Descripción
El kit de recuento celular 8 (CCK-8) es un kit de detección rápido y de alta sensibilidad basado en el reactivo WST-8 (sal monosódica de 2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio). El WST-8 es un reactivo mejorado de MTT y puede reducirse a un formazán de color amarillo anaranjado altamente soluble en agua mediante deshidrogenasas en las mitocondrias. La cantidad de formazán generada es proporcional al número de células vivas. El valor de DO del formazán a 450 nm detectado por un lector de microplacas puede indicar indirectamente el número de células viables. Este kit se utiliza ampliamente para la detección de fármacos, ensayos de proliferación celular y citotoxicidad, pruebas de sensibilidad a fármacos tumorales y detección de la actividad de factores biológicos.
Ventajas del método CCK-8
1. Comparación del método CCK-8 con otros métodos de detección de proliferación/toxicidad celular.
| Método de detección | Método MTT | Método XTT | WST - 1 método | Método CCK 8 |
|---|---|---|---|---|
| Solubilidad en agua del producto formazán | Bajo (es necesario agregar solvente orgánico para disolver y luego probar) | Alto | Alto | Alto |
| Características del producto | Polvo | 2 botellas de solución | Solución | 1 botella de solución |
| Modo de empleo | Mezclar en solución y utilizar. | La solución se preparó justo antes de su uso. | Fuera de la caja | Fuera de la caja |
| Sensibilidad de detección | Alto | Muy alto | Muy alto | Alto |
| Detección tiempo | Largo | Corto | Corto | El más corto |
| Longitud de onda de detección | 560-600 nm | 420-480 nm | 420-480 nm | 430-490 nm |
| citotoxicidad | Alta toxicidad, desaparición completa de la morfología celular. | Baja toxicidad, morfología celular sin cambios. | Bajo toxicidad, morfología celular sin cambios | Baja toxicidad, morfología celular sin cambios. |
| Estabilidad del reactivo | General | Bajo | General | Alto |
| Prueba de muestras a granel | Factible | Adecuado | Adecuado | Adecuado |
2. El rojo fenol y el suero no interfieren con la detección de CCK-8.
3. Como la citotoxicidad del reactivo CCK-8 es muy baja, el tiempo de medición óptimo se puede determinar leyendo repetidamente con un lector de microplacas en diferentes momentos después de agregar el reactivo CCK-8.
Envío y almacenamiento
El producto puede almacenarse a -25~-15ºC en un lugar seco y oscuro durante dos años.
Precauciones
1. En el primer experimento, se recomienda determinar el número óptimo de células sembradas y el tiempo de incubación óptimo del reactivo CCK-8.
2. Si es posible, utilice una pipeta multicanal para reducir las variaciones entre los pocillos replicados. Evite las burbujas en el experimento, ya que pueden interferir con la lectura de la DO. Al agregar el reactivo CCK-8, se recomienda agregarlo cerca de la pared de la placa de cultivo en lugar de insertarlo en el medio de cultivo.
3. Los glóbulos blancos pueden requerir un tiempo de incubación más largo.
4. Cuando se utiliza una placa estándar de 96 pocillos, el número de células sembradas es de al menos 1000 células/pocillo (100 μL). La sensibilidad de detección de los glóbulos blancos es relativamente baja, por lo que se recomienda sembrar al menos 2500 células/pocillo (100 μL). Si se utiliza una placa de 24 o 6 pocillos, se debe calcular el número correspondiente de células para cada pocillo y añadir el volumen adecuado de reactivo CCK-8 (el volumen de reactivo CCK-8 añadido es el 10 % del volumen del medio de cultivo en cada pocillo de la placa).
5.Si el filtro de 450 nm no está disponible, se puede utilizar un filtro con absorbancia entre 430 y 490 nm, pero el filtro de 450 nm puede lograr la mayor sensibilidad de detección.
6. El rojo fenol no afecta la medición ya que la absorbancia del rojo fenol en el medio se puede eliminar restando la absorbancia del grupo blanco.
7. Para su seguridad y salud, utilice bata de laboratorio y guantes desechables al realizar el experimento.
Instrucciones
I. Haz una curva estándar
1. Prepare la suspensión celular, determine la densidad celular y luego separe las células.
2. Diluir secuencialmente las células con el medio de cultivo según una determinada proporción (por ejemplo, una proporción de 1:2) para formar un gradiente de concentración celular, generalmente 3-5 gradientes de concentración celular, 3-6 pocillos replicados para cada concentración.
3. Después de sembrar, cultive las células durante 2 a 4 horas para que se adhieran. Luego, agregue el reactivo CCK-8, incube durante un período de tiempo determinado y mida el valor de DO. Dibuje una curva estándar con el número de células como eje X y el valor de DO como eje Y. De acuerdo con esta curva estándar, se puede determinar el número de células en una muestra desconocida (la premisa de usar esta curva estándar es que las condiciones experimentales deben ser consistentes).
II. Ensayo de viabilidad celular
1. Coloque las células en una placa de 96 pocillos (100 μL/pocillo). Coloque la placa en una incubadora (37 °C, 5 % de CO2).2) durante un período de tiempo para la preincubación.
2. Agregue 10 μL de reactivo CCK-8 a cada pocillo (tenga cuidado de no introducir burbujas en los pocillos, ya que interfieren con la lectura de DO) y mezcle suavemente.
3. Coloque la placa en la incubadora e incube durante 1 a 4 horas.
4. Mida la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas.
5. Si el valor de DO no se mide inmediatamente, agregue 10 μL de solución de HCl 0,1 M o solución de SDS al 1 % p/v a cada pocillo, cubra la placa y guárdela protegida de la luz a temperatura ambiente. El valor de absorbancia no cambiará en 24 horas.
III. Ensayo de proliferación celular y citotoxicidad
1. Coloque las células en una placa de 96 pocillos (100 μL/pocillo). Coloque la placa en una incubadora (37 °C, 5 % de CO2).2) durante 24 horas para la preincubación.
2. Añade a la placa 10 μL de diferentes concentraciones de la sustancia a ensayar.
3. Coloque la placa en la incubadora e incube durante un período de tiempo determinado (por ejemplo, 6, 12, 24 o 48 horas).
4. Agregue 10 μL de reactivo CCK-8 a cada pocillo (tenga cuidado de no introducir burbujas en los pocillos, ya que interfieren con la lectura de DO) y mezcle suavemente.
5. Coloque la placa en la incubadora e incube durante 1 a 4 horas.
6. Mida la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas.
7. Si el valor de DO no se mide inmediatamente, agregue 10 μL de solución de HCl 0,1 M o solución de SDS al 1 % p/v a cada pocillo, cubra la placa y guárdela protegida de la luz a temperatura ambiente. El valor de absorbancia no cambiará en 24 horas.
Nota: Si la sustancia es oxidante o reductora, reemplace el medio de cultivo antiguo con medio nuevo (retire el medio antiguo, lave las células dos veces con medio nuevo y luego agregue medio nuevo) antes de agregar el reactivo CCK-8 para eliminar el efecto de la sustancia.Si la sustancia en sí misma sólo tiene a leve efecto sobre el valor de absorbancia, no es necesario reemplazar el medio de cultivo y el efecto de la sustancia se puede eliminar restando el valor de absorbancia de un grupo en blanco con la sustancia.
Fórmula de cálculo
Tasa de supervivencia celular = [(AC) /(BC)] x100%
Tasa de inhibición = [(BA) /(BC)] x100%
A: La absorbancia del grupo experimental (la absorbancia del medio de cultivo que contiene células, el reactivo CCK-8 y la sustancia a ensayar)
B: Absorbancia del grupo de control (absorbancia del medio de cultivo que contiene células, reactivo CCK-8)
C: Absorbancia del grupo blanco (absorbancia del medio de cultivo que contiene el reactivo CCK-8)
Citas
[1] Sun L, Li P, Ju X, et al. En La caracterización estructural in vivo del genoma del ARN del SARS-CoV-2 identifica proteínas del huésped vulnerables a fármacos reutilizados. Cell. 2021;184(7):1865-1883.e20. doi:10.1016/j.cell.2021.02.008(SI:41.584)
[2] Wei S, Zhao Q, Zheng K, et al. La glutamilación de TAB1 vinculada a GFAT1 mantiene la activación de p38 MAPK y promueve la supervivencia de las células de cáncer de pulmón en condiciones de inanición de glucosa. Cell Discov. 2022;8(1):77. Publicado el 9 de agosto de 2022. doi:10.1038/s41421-022-00423-0(SI:38.079)
[3] Chen X, Zhang D, Su N, et al. Visualización de la dinámica del ARN en células vivas con ARN fluorescentes brillantes y estables. Nat Biotechnol. 2019;37(11):1287-1293. doi:10.1038/s41587-019-0249-1(SI:31.864)
[4] Yang F, Xiao Y, Ding JH, et al. La heterogeneidad de la ferroptosis en el cáncer de mama triple negativo revela una innovadora estrategia de combinación de inmunoterapia [publicado en línea antes de la impresión, 11 de octubre de 2022]. Cell Metab. 2022;S1550-4131(22)00411-9. doi:10.1016/j.cmet.2022.09.021(SI:31.373)
[5] Rong QX, Wang F, Guo ZX, et al. GM-CSF media la evasión inmunitaria a través de la regulación positiva de la expresión de PD-L1 en el linfoma de células T/asesinas naturales extranodales. Mol Cancer. 2021;20(1):80. Publicado el 29 de mayo de 2021. doi:10.1186/s12943-021-01374-y(SI:27.401)
[6] Xia B, Shen X, He Y, et al. La proteína de la envoltura del SARS-CoV-2 provoca daños patológicos similares al síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y constituye un objetivo antiviral. Cell Res. 2021;31(8):847-860. doi:10.1038/s41422-021-00519-4(SI:25.617)
[7] Yang X, Zhao X, Zhu Y, et al. FBXO34 promueve la activación latente del VIH-1 mediante modulación postranscripcional. Emerg Microbes Infect. 2022;11(1):2785-2799. doi:10.1080/22221751.2022.2140605(SI:19.568)
[8] Zhou Z, Zhang X, Lei X, et al.La detección de la cromatina citoplasmática por cGAS activa la respuesta inmunitaria innata en la infección por SARS-CoV-2. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):382. Publicado el 3 de noviembre de 2021. doi:10.1038/s41392-021-00800-3(SI:18.187)
[9] Li M, Hao B, Zhang M, et al. La melatonina mejora la inmunidad antitumoral de las células NK inducida por radiofrecuencia, lo que provoca la reprogramación del metabolismo del cáncer y la inhibición del desarrollo de múltiples tumores pulmonares. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):330. Publicado el 1 de septiembre de 2021. doi:10.1038/s41392-021-00745-7(SI:18.187)
[10] Qi S, Zhu Y, Liu X, et al. Las proteínas WWC median la activación de LATS1/2 por las quinasas Hippo e implican una estrategia de supresión tumoral. Mol Cell. 2022;82(10):1850-1864.e7. doi:10.1016/j.molcel.2022.03.027(SI:17.970)
[11] Zhu J, Li X, Cai X, et al. La monometilación de arginina por PRMT7 controla la inmunidad innata antiviral mediada por MAVS. Mol Cell. 2021;81(15):3171-3186.e8. doi:10.1016/j.molcel.2021.06.004(SI:17.970)
[12] Teng KX, Niu LY, Xie N, Yang QZ. Agentes fotodinámicos supramoleculares para la oxidación simultánea de NADH y la generación de radicales superóxido. Nat Commun. 2022;13(1):6179. Publicado el 19 de octubre de 2022. doi:10.1038/s41467-022-33924-3(SI:17.694)
[13] Zhong J, Guo Y, Lu S, et al. Diseño racional de un trazador con sensibilidad mejorada para descubrir inhibidores eficientes de APC-Asef. Nat Commun. 2022;13(1):4961. Publicado el 24 de agosto de 2022. doi:10.1038/s41467-022-32612-6(SI:17.694)
[14] Liu F, Wang X, Duan J, et al. Una degradación secuencial de AURKA mediada por un cóctel PROTAC temporal anula las células madre de la leucemia mieloide aguda. Adv Sci (Weinh). 2022;9(22):e2104823. doi:10.1002/advs.202104823(SI:16.806)
[15] Ji C, Qiu M, Ruan H, et al. El análisis del transcriptoma reveló el nicho de simbiosis de los andamios 3D para acelerar la curación de defectos óseos. Adv Sci (Weinh). 2022;9(8):e2105194. doi:10.1002/advs.202105194(SI:16.806)
[16] Feng L, Dou C, Xia Y, et al. Terapia con nanozimas recubiertas de membranas celulares similares a los neutrófilos para el daño cerebral isquémico y la recuperación funcional neurológica a largo plazo. ACS Nano. 2021;15(2):2263-2280. doi:10.1021/acsnano.0c07973(SI:15.881)
[17] Wang Z, Gong X, Li J, et al. Los nanovehículos de polifluorocarbono que suministran oxígeno mejoran la oxigenación tumoral y potencian la inmunidad antitumoral mediada por fotodinámica. ACS Nano. 2021;15(3):5405-5419. doi:10.1021/acsnano.1c00033(SI:15.881)
[18] Jiang Z, He L, Yu X, et al. La antiangiogénesis combinada con la inhibición de la vía de la hipoxia facilita la terapia fotodinámica inducida por rayos X de dosis baja [publicado en línea antes de la impresión, 25 de junio de 2021]. ACS Nano. 2021;10.1021/acsnano.1c01063. doi:10.1021/acsnano.1c01063(SI:15.881)
[19] Gong X, Li J, Xu X, et al. Un nanosistema de suministro de oxígeno inspirado en microvesículas potencia la modulación del estroma tumoral y la inmunidad antitumoral mediada por radioterapia. Biomateriales. 2022;290:121855. doi:10.1016/j.biomaterials.2022.121855(SI:15.304)
[20] Deng J, Xu W, Lei S, et al. Reclutamiento y maduración de células dendríticas dependientes de células asesinas naturales activadas mediante nanogeles sensibles para la inmunoterapia dirigida contra el cáncer de páncreas. Small. 2022;18(44):e2203114. doi:10.1002/smll.202203114(SI:15.153)
Pago y seguridad
Su información de pago se procesa de forma segura. No almacenamos detalles de la tarjeta de crédito ni tenemos acceso a la información de su tarjeta de crédito.
Consulta
También te puede gustar
Preguntas frecuentes
El producto es solo para fines de investigación y no está destinado a uso terapéutico o diagnóstico en humanos o animales. Los productos y el contenido están protegidos por patentes, marcas comerciales y derechos de autor propiedad de Yeasen Biotechnology. Los símbolos de marca comercial indican el país de origen, no necesariamente el registro en todas las regiones.
Algunas aplicaciones pueden requerir derechos de propiedad intelectual adicionales de terceros.
Yeasen se dedica a la ciencia ética y cree que nuestra investigación debe abordar cuestiones críticas al tiempo que garantiza la seguridad y los estándares éticos.