El kit de detección de apoptosis celular Annexin V-EGFP/PI utiliza Annexin V marcado con EGFP como sonda para detectar la aparición de apoptosis celular temprana.
El principio de detección es el siguiente: en las células vivas normales, la fosfotidilserina (PS) se encuentra en el lado interno de la membrana celular, pero en las células apoptóticas tempranas, la PS se desplaza desde el lado interno de la membrana celular a la superficie de la membrana celular y queda expuesta al entorno extracelular. La anexina-V es un Ca²⁺ Proteína de unión a fosfolípidos dependiente de fosfatidilserina con un peso molecular de 35 a 36 kDa que se une a la PS con alta afinidad. La fosfatidilserina puede unirse a la membrana de las células apoptóticas tempranas a través de la fosfatidilserina expuesta en el exterior de la célula.
Además, se proporciona yoduro de propidio (PI) para distinguir las células supervivientes tempranas de las células necróticas o apoptóticas tardías. El PI es un colorante de ácido nucleico que no puede atravesar la membrana celular intacta de las células normales o de las células apoptóticas tempranas, pero puede atravesar la membrana celular de las células apoptóticas tardías y necróticas y hacer que el núcleo sea rojo. Por lo tanto, cuando se combinó la anexina V con PI, se excluyó al PI de las células vivas (anexina V^-/PI^-) y células apoptóticas tempranas (Anexina V⁺/PI^-). Las células apoptóticas tardías y necróticas fueron doblemente positivas tanto para EGFP como para PI (Anexina V).⁺/PI⁺).
Este kit es adecuado para citometría de flujo y microscopía de fluorescencia.

Componentes del producto

Envío y almacenamiento

Los componentes se envían con una bolsa de hielo y pueden almacenarse a -20 °C, protegidos de la luz y evitando la congelación y descongelación repetidas durante 1 año.
[Notas]: Si es necesario usarlo repetidamente en un período corto, se puede almacenar a 4 ℃ y protegerlo de la luz durante medio año.

Precauciones

1) Dado que la apoptosis es un proceso rápido, se recomienda que las muestras se analicen dentro de 1 hora después de la tinción.
2) Para las células adherentes, la digestión es un paso fundamental. No utilice EDTA en la solución digestiva, ya que el EDTA puede afectar la unión de la anexina V a la fosfatasa alcalina.
3) La anexina V-FITC, pero no la anexina V-EGFP, se debe utilizar para fijar células, por ejemplo, para detectar la apoptosis y el ciclo celular al mismo tiempo, porque la EGFP se desnaturalizaría y perdería su capacidad de excitar la fluorescencia durante la fijación. Las células se incubaron con anexina V-FITC antes de la fijación y la anexina V-FITC no unida se eliminó con tampón de unión.Esto se debe a que el aumento de la permeabilidad celular durante la fijación crea residuos celulares que pueden unirse a la Anexina V e interferir con los resultados.
4) Si la muestra es de sangre, asegúrese de eliminar las plaquetas de la sangre, ya que contienen PS, que puede unirse a la anexina V e interferir en los resultados. Las plaquetas se pueden eliminar mediante el uso de un agente tampón que contenga EDTA y centrifugando a 200 g.
5) Centrifugue brevemente el reactivo antes de abrir la tapa y arroje el líquido de la pared interior de la tapa al fondo del tubo para evitar que se salpique el líquido al abrir la tapa.
6) La anexina V-EGFP y PI son sustancias fotosensibles, por lo que se debe evitar la luz durante su funcionamiento.
7) ¡Solo para uso en investigación!

Instrucciones

Diseño de experimentos
Tubo blanco: Se utilizaron células de control negativo sin anexina V-EGFP y solución de tinción PI para la regulación del voltaje.
Tubos teñidos individualmente: se utilizaron células de control positivo, suplementadas únicamente con Anexina V-EGFP, para modular la compensación.
Tubo de detección: Las células fueron tratadas con anexina V-EGFP y solución de tinción PI. Los datos experimentales se obtuvieron ajustando los parámetros del tubo en blanco y del tubo de tinción simple.
1.1 Muestra de teñido
1) celda de suspensión: Las células se recogieron mediante centrifugación a 300 g durante 5 min a 4 °C.
Célula adherente: Después de la digestión con tripsina sin EDTA, las células se recolectaron mediante centrifugación a 300 g durante 5 min a 4 ° C. El tiempo de digestión con tripsina no debe ser demasiado largo para evitar falsos positivos.
2) Las células se lavaron con PBS preenfriado dos veces, cada vez a 300 g, y se centrifugaron a 4 ℃ durante 5 min.
3) Las células se resuspendieron con tampón de unión 1× y la concentración se ajustó a 1~5 ×106/mL.
4) Se agregaron 100 μL de suspensión celular a tubos de citometría de flujo de 5 mL, se agregaron 5 μl de Anexina V-EGFP y las células se mezclaron e incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente bajo la luz.
5) Añadiendo 10 μl de solución PI y 400 μl de PBS se realizó inmediatamente la tinción.
[Notas]: Cuando se utiliza la citometría de flujo para detectar la apoptosis, el PI se ve muy afectado por el tiempo, y un tiempo demasiado prolongado conducirá a un aumento en la tinción de PI, por lo que la citometría de flujo debe completarse dentro de 1 hora.
1.2 Análisis por citometría de flujo
La longitud de onda de excitación máxima de EGFP fue de 488 nm y la longitud de onda de emisión máxima fue de 507 nm; la longitud de onda de excitación máxima del complejo PI-ADN fue de 535 nm y la longitud de onda de emisión máxima fue de 615 nm. Se utilizó un software como CellQuest para el análisis y se dibujó un diagrama de puntos de dos colores, EGFP es la abscisa y PI es la ordenada. Recolecte 10,000 eventos por muestra. En un experimento típico, las células se pueden dividir en tres subgrupos, las células vivas solo tienen fluorescencia de fondo de intensidad muy baja, las células apoptóticas tempranas solo tienen fluorescencia verde fuerte y las células apoptóticas tardías tienen doble tinción de fluorescencia verde y roja.