El principio de detección del kit de detección de apoptosis Annexin V-Alexa Fluor488/PI es el siguiente: en las células vivas normales, la fosfotidilserina (PS) se encuentra en el lado interno de la membrana celular, pero en las células apoptóticas tempranas, la PS se desplaza desde el lado interno de la membrana celular a la superficie de la membrana celular y queda expuesta al entorno extracelular. Annexin-V es un Ca²⁺ -Proteína de unión a fosfolípidos dependiente de fosfatidilserina con un peso molecular de 35 a 36 KD, que se une con alta afinidad a la PS y se une a la membrana celular de las células apoptóticas tempranas a través de la fosfatidilserina expuesta en el exterior de la célula.
Además, se proporciona yoduro de propidio (PI) para distinguir las células supervivientes tempranas de las células necróticas o apoptóticas tardías. El PI es un colorante de ácido nucleico que no puede atravesar la membrana celular intacta de las células normales o de las células apoptóticas tempranas, pero puede atravesar la membrana celular de las células apoptóticas tardías y necróticas y hacer que el núcleo sea rojo. Por lo tanto, cuando se combinó la anexina V con PI, se excluyó al PI de las células vivas (anexina V^-/PI^-) y células apoptóticas tempranas (Anexina V⁺/PI^-). Por el contrario, las células apoptóticas tardías y necróticas fueron doblemente positivas para Alexa Fluor488 y PI (Anexina V).⁺/PI⁺).

Componentes del producto

Envío y almacenamiento

Los componentes se envían con una bolsa de hielo y pueden almacenarse a -20 °C durante 1 año.

Precauciones

1) Dado que la apoptosis es un proceso rápido, se recomienda que las muestras se analicen dentro de 1 hora después de la tinción.
2) Para las células adherentes, la digestión es un paso fundamental. No utilice EDTA en la solución digestiva, ya que el EDTA puede afectar la unión de la anexina V a la fosfatasa alcalina.
3) Si la muestra es de sangre, asegúrese de eliminar las plaquetas de la sangre, ya que contienen PS, que puede unirse a la anexina V e interferir en los resultados. Se puede utilizar un agente tampón que contenga EDTA y eliminar las plaquetas mediante centrifugación a 200 g.
4) Centrifugue brevemente el reactivo antes de abrir la tapa y arroje el líquido de la pared interior de la tapa al fondo del tubo para evitar que se salpique el líquido al abrir la tapa.
5) Annexin V-Alexa Fluor488 y PI son sustancias fotosensibles y deben mantenerse alejadas de la luz durante su manipulación.
6) ¡Solo para uso en investigación!

Instrucciones

1.1 muestra de teñido
1.a) celda de suspensión: Las células se recogieron mediante centrifugación a 300 g durante 5 minutos a 4 °C.
b) Células adherentes: Después de la digestión con tripsina sin EDTA, las células se recolectaron mediante centrifugación a 300 g durante 5 min a 4 °C. El tiempo de digestión con tripsina no debe ser demasiado largo para evitar falsos positivos.
2. Las células se lavaron dos veces con PBS preenfriado a 4 °C, cada vez utilizando 300 g, y se centrifugaron a 4 °C durante 5 min.
3. Las células se resuspendieron agregando 250 μL de tampón de unión 1× y la concentración se ajustó a 1×106/mL.
Se agregaron 4. 100 μL de suspensión celular a un tubo de citometría de flujo de 5 mL, se agregaron 5 μL de Annexin V-Alexa Fluor 488 y 10 μL de PI y se mezclaron suavemente.
5. La reacción se mantuvo alejada de la luz y a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Se agregaron 400 μL de tampón de unión 1×, se mezclaron y las muestras se detectaron mediante citometría de flujo en 1 hora.
[Notas]: Para evitar la pérdida de células durante el lavado celular, se puede utilizar una punta pequeña para aspirar el líquido.
1.2 Análisis por citometría de flujo
Alexa Fluor488 tiene una longitud de onda de excitación máxima de 488 nm y una longitud de onda de emisión máxima de 519 nm; la longitud de onda de excitación máxima del complejo PI-ADN fue de 535 nm y la longitud de onda de emisión máxima fue de 615 nm. Se utilizó CellQuest y otro software para analizar y dibujar un gráfico de puntos de dos colores con Alexa Fluor488 como abscisa y PI como ordenada. Recopilar 10 000 eventos por muestra.
1.3 Análisis por microscopía de fluorescencia
1) Coloque una gota de la suspensión celular doblemente teñida con Anexina V-FITC/PI en el portaobjetos y cubra las células con un cubreobjetos.
2) Se observó bajo un microscopio de fluorescencia con un filtro de dos colores. La señal de fluorescencia de Annexin V-FITC fue verde y la señal de fluorescencia de PI fue roja.