Cuando las células sufren apoptosis, activan enzimas endonucleasas que cortan el ADN genómico entre los nucleosomas. Después de extraer el ADN durante la apoptosis, se pudo encontrar una escalera de ADN de 180-200 pb.
El kit de detección de apoptosis TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) (Alexa Fluor 640) se puede utilizar para detectar la fragmentación del ADN nuclear en el proceso apoptótico tardío de las células tisulares. El principio es que bajo la acción de la Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT), Alexa Fluor 640-12-DUTP se incorpora en el terminal 3'-hidroxilo (3'-OH) expuesto durante la rotura del ADN genómico. Por lo tanto, se puede detectar mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo. Alexa Fluor 640 es un colorante fluorescente rojo con alta estabilidad y fuerte brillo.
Este kit tiene una amplia gama de aplicaciones y puede utilizarse para detectar apoptosis en secciones congeladas o en parafina, así como en células adherentes o suspendidas cultivadas.

Componentes del producto

Envío y almacenamiento

Los componentes se envían con una bolsa de hielo y pueden almacenarse a -20 °C durante 1 año.

Precauciones

1. Es necesario preparar su propio PBS para lavar las células, una solución de extinción de fluorescencia para sellar las tabletas y paraformaldehído al 4 % para la fijación. Es posible que sea necesario cultivar los leucocitos durante un tiempo prolongado.
2. ¡Solo para uso en investigación!

Instrucciones

1. La preparación de la muestra
1.1 Secciones de tejido incluidas en parafina
1.1.1.Las secciones de tejido parafinado se sumergieron en xileno durante 5 minutos a temperatura ambiente y se repitió una vez para eliminar completamente la parafina.
1.1.2.Remojar las secciones en etanol al 100% durante 5 minutos a temperatura ambiente y repetir una vez.
1.1.3.A temperatura ambiente, las muestras se remojaron con etanol en gradiente (90, 80, 70%) durante 3 minutos cada vez.
1.1.4. Enjuague las secciones suavemente con PBS y seque cuidadosamente el exceso de líquido alrededor de la muestra en los portaobjetos de vidrio con papel de filtro. En este caso, se puede utilizar un bolígrafo de parafina o un bolígrafo hidrófobo para dibujar el contorno de la distribución de la muestra alrededor de la muestra, lo que resulta conveniente para el procesamiento de permeabilidad posterior y la operación de etiquetado de equilibrio. No deje que la muestra se seque durante el experimento. Coloque la muestra procesada en la caja húmeda para mantenerla húmeda.
La solución de proteinasa K 1.1.5.2 mg/mL se diluyó con PBS en una proporción de 1:100 para alcanzar una concentración final de 20 μg/mL.
1.1.6. Se añadió 100 μL de solución de proteinasa K a una concentración de 20 μg/mL a cada muestra para cubrirla completamente y se incubó a temperatura ambiente durante 20 min.
[Notas]: La proteinasa K ayuda a que los tejidos y las células se vuelvan permeables a los reactivos de tinción en los pasos posteriores. Un tiempo de incubación demasiado prolongado aumentará el riesgo de que las secciones de tejido se caigan de la placa portadora en los pasos de lavado posteriores, mientras que un tiempo de incubación demasiado corto puede provocar un tratamiento de permeabilidad insuficiente y afectar la eficiencia del marcado. Para obtener mejores resultados, puede ser necesario optimizar el tiempo de incubación de la proteinasa K.
1.1.7. Enjuagar la muestra 2 o 3 veces con solución PBS, retirar con cuidado el exceso de líquido y secar cuidadosamente el líquido alrededor de la muestra en el portaobjetos con papel de filtro. La muestra procesada se coloca en una caja húmeda para mantenerla húmeda.
1.2 Sección congelada de tejido
1.2.1. Retirar las secciones congeladas y devolverlas a temperatura ambiente. Las láminas se sumergieron en una solución de paraformaldehído al 4 % (disuelta en PBS) y se fijaron e incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente.
1.2.2. Retire con cuidado el exceso de líquido y utilice papel de filtro para secar con cuidado el exceso de líquido alrededor de la muestra en el portaobjetos de vidrio.
1.2.3. Los portaobjetos se sumergieron en solución de PBS, se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos y se lavaron con PBS nuevamente 2 veces en total.
1.2.4. Retire con cuidado el exceso de líquido y seque cuidadosamente el portaobjetos de vidrio con papel de filtro para eliminar el exceso de líquido alrededor de la muestra. En este caso, se puede utilizar un bolígrafo de parafina o un bolígrafo hidrófobo para dibujar el contorno de la distribución de la muestra alrededor de la muestra, lo que resulta conveniente para el procesamiento de permeabilidad posterior y la operación de etiquetado de equilibrio. Durante el experimento, no deje que la muestra se seque y coloque la muestra procesada en la caja húmeda para mantenerla húmeda.
1.2.5. La solución de proteinasa K de 2 mg/mL se diluyó con PBS en una proporción de 1:100 para alcanzar una concentración final de 20 μg/mL.
1.2.6. Se agregaron 100 μL de solución de Proteinasa K a una concentración de 20 μg/mL a cada muestra para cubrirla completamente y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min.
[Notas]: La proteinasa K ayuda a que los tejidos y las células sean permeables a los reactivos de tinción en los pasos posteriores. Un tiempo de incubación demasiado prolongado aumentará el riesgo de que las secciones de tejido se caigan de la placa portadora en los pasos de lavado posteriores, mientras que un tiempo de incubación demasiado corto puede provocar un tratamiento de permeabilidad insuficiente y afectar la eficiencia del marcado. Puede ser necesario optimizar el tiempo de incubación de la proteinasa K si no se obtienen mejores resultados.
1.2.7. Enjuague la muestra 2-3 veces en un vaso de precipitados abierto que contenga solución PBS.
[Notas]: Para evitar la pérdida de la muestra pelada en el paso de limpieza, se recomienda no lavar la botella, sino remojar los portaobjetos de vidrio en solución PBS 2-3 veces para limpiarlos.
1.2.8. Retire con cuidado el exceso de líquido y utilice papel de filtro para secar con cuidado el líquido alrededor de la muestra en el portaobjetos.La muestra procesada se coloca en una caja húmeda para preservar la humedad de la muestra.
1.3 Preparación de la hoja de rastreo celular
Las células adherentes se cultivaron en portaobjetos de cámara Lab-Tek. Después del tratamiento de inducción de apoptosis, los portaobjetos se lavaron dos veces con PBS.
1.4 Preparación de frotis celulares (tomando como ejemplo portaobjetos recubiertos con polilisina)
1.4.1. Las células se resuspendieron en PBS a una concentración de aproximadamente 2×107 células/ml, se aspiraron 50-100 μL de la suspensión celular sobre portaobjetos recubiertos con polilisina y la suspensión celular se abrió con cuidado con un portaobjetos limpio.
1.4.2. Las células se fijaron y los portaobjetos se sumergieron en un tanque de tinción que contenía paraformaldehído recién preparado al 4% en PBS y se colocaron a 4 °C durante 25 min.
1.4.3. Se lavaron los portaobjetos, se sumergieron en PBS y se dejaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se lavaron nuevamente con PBS.
1.4.4. Retire con cuidado el exceso de líquido y seque cuidadosamente el portaobjetos de vidrio con papel de filtro para eliminar el exceso de líquido alrededor de la muestra. En este caso, se puede utilizar un bolígrafo de parafina o un bolígrafo hidrófobo para delinear la distribución de la muestra alrededor de la muestra para facilitar el procesamiento de permeabilidad posterior y las operaciones de etiquetado de equilibrio. Durante el experimento, no deje que la muestra se seque y coloque la muestra procesada en la caja húmeda para mantenerla húmeda.
1.4.5. La solución de proteinasa K de 2 mg/mL se diluyó con PBS en una proporción de 1:100 para alcanzar una concentración final de 20 μg/mL.
1.4.6. A cada muestra se le agregó 100 μL de solución de Proteinasa K a una concentración de 20 μg/mL para cubrirla completamente y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min (también se puede sumergir en solución de Triton X-100 al 0,2% preparada en PBS e incubar a temperatura ambiente durante 5 min para el tratamiento de permeabilidad).
[Notas]: La proteinasa K ayuda a que los tejidos y las células sean permeables a los reactivos de tinción en los pasos posteriores. Un tiempo de incubación demasiado prolongado aumentará el riesgo de que las secciones de tejido se caigan de la placa portadora en los pasos de lavado posteriores, mientras que un tiempo de incubación demasiado corto puede provocar un tratamiento de permeabilidad insuficiente y afectar la eficiencia del marcado. Puede ser necesario optimizar el tiempo de incubación de la proteinasa K si no se obtienen mejores resultados.
1.4.7. Enjuagar la muestra 2 o 3 veces con PBS, retirar con cuidado el exceso de líquido y secar cuidadosamente el líquido alrededor de la muestra en el portaobjetos con papel de filtro. Las muestras procesadas se colocaron en una caja húmeda.
2. Pasos para el tratamiento con DNasa de los controles positivos
Después de la permeación de la muestra, Las células se trataron con DNasa I para preparar portaobjetos de control positivo. Este proceso suele provocar que la mayoría de las células Tratado para mostrar fluorescencia verde.
[Notas]: El tratamiento con ADNasa I de células inmovilizadas provoca la rotura del ADN cromosómico, produciendo muchos extremos 3' de ADN que pueden marcarse.
2.1. Diluir el tampón DNasa I 10× con agua desionizada en una proporción de 1:10 (se requieren 200 µL de tampón DNasa I 1× para cada muestra, es decir, se requieren 20 µL de tampón DNasa I 10× y 180 µL de agua desionizada para la dilución). Se añadió una gota de 100 µL a la muestra permeable y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Añadir 1 µL de DNasa I (1 U/µL) a los 100 µL restantes de tampón DNasa I 1× para lograr una concentración final de 10 U/mL.
2.2.Se retiró el líquido con cuidado, luego se agregaron 100 μL de tampón que contenía 10 U/mL de DNasa I y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente.
2.3. Golpee el portaobjetos para eliminar el exceso de líquido y lávelo minuciosamente 3 o 4 veces en un tanque de tinción con agua desionizada.
[Notas]: Se debe utilizar un tanque de tinción separado para los portaobjetos de control positivo; de lo contrario, la DNasa I residual en los portaobjetos de control positivo puede introducir un fondo alto en los portaobjetos experimentales.
3. Etiquetado y detección
3.1.El tampón de equilibrio (tampón de equilibrio 5 x) se diluye con agua desionizada en una proporción de 1:5 (se requieren 100 μL de tampón de equilibrio 1 x para cada muestra).
3.2. Se añadió tampón de equilibrio (100 μL de tampón de equilibrio 1×) a cada muestra para equilibrar completamente el área y se incubó durante 10-30 min a temperatura ambiente. Alternativamente, coloque los portaobjetos en una cubeta con tampón de equilibrio 1× para asegurarse de que los portaobjetos no equilibren la muestra. Descongele la mezcla de etiquetado Alexa Fluor 640-12-dUTP en hielo mientras equilibra las células y prepare suficiente tampón de incubación de TdT para todos los experimentos y las reacciones de control positivo opcionales de acuerdo con la Tabla 1. Para una reacción estándar con un área de menos de 5 cm2, el volumen es de 50 μL y 50 μL se multiplican por la cantidad de reacciones experimentales y de control positivo para determinar el volumen total de tampón de incubación de TdT requerido. Para muestras con áreas de superficie más grandes, el volumen del reactivo se puede aumentar proporcionalmente.

Tabla 1. Tampones de incubación de TdT preparados para experimentos y reacciones de control positivo opcionales

[Sistema de control negativo]: Se preparó un tampón de incubación de control sin la enzima TdT y la enzima TdT se reemplazó con ddH2O.
3.3. La mayor parte de los 100 μL de tampón de equilibrio 1× se lavaron con papel absorbente alrededor del área equilibrada y luego se agregaron 50 μLTdT de tampón de incubación a un área de 5 cm2 de células. No deje que las células se sequen. Después de esto, el portaobjetos debe protegerse de la luz.
3.4. Coloque un cubreobjetos de plástico sobre las células para asegurar una distribución uniforme de los reactivos y coloque una toalla de papel humedecida con agua en el fondo de la caja húmeda. Los portaobjetos se colocaron en una caja húmeda y se incubaron a 37 °C durante 60 min. Envuelva la caja húmeda en papel aluminio para protegerla de la luz.
[Notas]: El cubreobjetos de plástico se puede cortar por la mitad antes de usarlo. Doblar el borde del cubreobjetos para facilitar su extracción y manipulación.
3.5. Se retiraron los cubreobjetos de plástico y las secciones se incubaron en solución de PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, las secciones se lavaron dos veces con PBS fresco.
3.6. Limpie suavemente la solución PBS alrededor y en la parte posterior de la muestra con papel de filtro.
[Notas]: Para reducir el fondo, después de lavar los portaobjetos con PBS una vez, se pueden lavar con PBS que contenga 0,1 % de Triton X-100 y 5 mg/mL de BSA 3 veces, 5 minutos cada vez, para que los marcadores libres sin reaccionar queden claros y limpios.
3.7. Las muestras se tiñeron en un tanque de tinción y los portaobjetos se sumergieron en un tanque de tinción que contenía solución de PI (1 μg/mL, recién preparada y diluida con PBS) en la oscuridad y se dejaron a temperatura ambiente durante 5 min. (Opcional): Las muestras se tiñeron en un tanque de tinción y los portaobjetos se sumergieron en un tanque de tinción que contenía solución de DAPI (2 μg/mL, recién preparada y diluida con PBS) en la oscuridad y se dejaron a temperatura ambiente durante 5 min.
3.8.Lave la muestra, sumerja el portaobjetos en agua desionizada y déjelo a temperatura ambiente durante 5 minutos. Repita el proceso dos veces para un total de tres lavados.
3.9. Se secó el exceso de agua en el portaobjetos y se agregaron 100 μl de PBS al área de la muestra para mantenerla húmeda.
3.10. Las muestras se analizaron inmediatamente con un microscopio de fluorescencia, se detectó fluorescencia roja de Alexa Fluor 640 a 620 nm y se observó DAPI azul a 460 nm. DAPI podía teñir de azul tanto las células apoptóticas como las no apoptóticas, y solo en los núcleos apoptóticos se incorporó Alexa Fluor 640-12-dUTP y localizó la fluorescencia roja. Si es necesario, las láminas se pueden almacenar durante la noche a 4 °C en la oscuridad.
4. Las células en suspensión se detectaron mediante citometría de flujo.
4.1. Se lavaron 3~5×106 células dos veces con PBS mediante centrifugación (300×g) a 4 °C, se centrifugaron a 300 g a 4 °C durante 10 min y luego se resuspendieron en 0,5 mL de PBS.
4.2. Se fijaron las células y se añadieron 5 mL de solución de paraformaldehído al 1% preparada en PBS y se colocaron en hielo durante 20 minutos.
4.3. Las células se centrifugaron a 300 × g a 4 °C durante 10 min y se eliminó el sobrenadante y se resuspendió en 5 mL de PBS. El lavado se repitió una vez y las células se resuspendieron con 0,5 mL de PBS.
4.4. Las células se permeabilizaron y se añadieron 5 ml de etanol al 70 % previamente enfriado con hielo y se incubaron a -20 °C durante 4 horas. Las células se podían almacenar en etanol al 70 % a -20 °C durante una semana, o se podían permeabilizar con una solución de Triton X-100 al 0,2 % preparada en PBS y almacenada a temperatura ambiente durante 5 min.
4.5. Las células se centrifugaron a 300 × g durante 10 min y se resuspendieron en 5 ml de PBS. Se repitió la centrifugación y se resuspendieron en 1 ml de PBS.
4.6. Transfiera 2 × 106 células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
4.7. Se centrifugó a 300 × g durante 10 min y se retiró el sobrenadante y se resuspendió con 80 μL de tampón de equilibrio 1 ×. Se incubó a temperatura ambiente durante 5 min.
4.8. Mientras se equilibraban las células, se fundió en hielo la mezcla de etiquetado Alexa Fluor 640-12-dUTP y se preparó una cantidad suficiente de tampón de incubación de TdT para todas las reacciones de acuerdo con la Tabla 1. Para una reacción estándar de 2 × 106 células, el volumen fue de 50 μL y se multiplicaron 50 μL por la cantidad de reacciones para determinar el volumen total de tampón de incubación de TdT requerido.
4.9. Las células se centrifugaron a 300 × g durante 10 min, se eliminó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió en 50 μL de tampón de incubación TdT y se incubó a 37 ℃ durante 60 min, protegido de la luz. Las células se resuspendieron suavemente cada 15 min con una micropipeta.
4.10. La reacción se finalizó añadiendo 1 ml de EDTA 20 mM y mezclando suavemente con una micropipeta.
4.11. Después de centrifugar a 300 g durante 10 min, se descartó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió en 1 ml de solución de Triton X-100 al 0,1 % preparada en PBS, que contenía 5 mg/ml de BSA. La solución se repitió una vez y se lavó dos veces en total.
4.12. Las células se analizaron mediante citometría de flujo y se midió la fluorescencia roja Alexa Fluor 640 a 620 nm.