Instrucciones

1. Preparaciones antes del experimento

1） Prepare los reactivos y materiales necesarios que se utilizarán en el experimento.

2）Confirmar la idoneidad de El instrumento qPCR

Este kit se puede utilizar en los tipos de instrumentos qPCR que se indican a continuación:

1. Bio-Rad: CFX96
2. Thermo Scientific: Sistema de PCR en tiempo real 7500; QuantStudio™5;
3. Método experimental

1） Extracción de ADN

Recomendamos utilizar ' Kit de preparación de muestras de ADN residual magnético (Cat#18461ES para extracción manual y Cat#18462ES para extracción automática) para el Extracción de ADN, tú poder visita ' http:/www.yeasenbiotech.com '  para el

Información detallada y la compra.

El kit (Cat#40619ES) contiene un control interno (CI). Si se agrega el CI a las muestras antes de la extracción de ADN, se puede verificar el proceso completo (incluida la extracción de ADN y la reacción de qPCR). Si se agrega el CI a la mezcla maestra de qPCR

directamente, El IC actuará únicamente como control de qPCR.

2) Preparación de la mezcla qPCR

1. De acuerdo con la cantidad de muestra que incluía control positivo (PCS), control sin plantilla (NTC) y control negativo  Solución de control (NCS) y muestra de prueba (TS) para calcular el número de reacciones. Prepare 2 reacciones en paralelo para

Cada muestra en general.

* PCS: Positivo control Solución;NTC: No plantilla control;NCS:Negativo control solución;TS:Prueba muestra. Hay es No necesidad a llevar a cabo

el muestra extracción para Piezas y NTC, pero CN y TS son necesario.

Pozos de reacción (M1) = (1×NCS + N×TS） ×2

Pozos de reacción (M2) = (1×PCS + 1×NTC) ×2

Pozos de reacción (M3) = (1×PCS + 1×NTC + N×TS) ×2

1. Descongele previamente la cantidad necesaria de reactivos en hielo de acuerdo con el diseño del experimento y las tablas siguientes.
2. Calcule la cantidad de mezcla de qPCR según el número de reacciones. Tenga en cuenta que, si el kit se utilizará para actividades de GMP, como la liberación del producto, recomendamos utilizar las Tablas 1 y 2 para la preparación; El kit lo hará justo utilizado para investigación y no es necesario agregar IC antes de la extracción después de la evaluación, luego siga la Tabla 3 para

La preparación. Tenga en cuenta que no todos los modelos M1, M2 y M3 son necesario para ser preparar.

Tabla 1 Sistema de mezcla qPCR para M1

*El configuración sistema en Mesa 1 es basado en el premisa eso CI es agregado antes extracción para ambos CN y TS, entonces él es no necesario

a agregar CI cuando PCR cuantitativa Mezcla preparación. IC añadiendo método antes extracción: En primer lugar, diluir CI por 20 veces con ADN diluyente, y agregar 1 μl

diluido CI en cada 100 μl prueba muestra para el más extracción.

**Este equipo hace no contener ROX Referencia Teñir. Si ROX referencia teñir es necesario para el Real Tiempo PCR amplificadores eso tú son actualmente usando, 50×ROX Referencia Teñir (Cat#10200ES) es recomendado para usar. En este caso, el agregado volumen es 0,8 μl, como mostrado en Mesa 1. Si usando otro

marcas de ROX productos, por favor referirse a su instrucciones para ROX suma.Si No ROX referencia teñir es requerido, el agregado volumen es 0 microlitros.

Tabla 2 Sistema de mezcla qPCR para M2

*El configuración sistema en Mesa 2 es basado en el premisa eso CI es no agregado en Piezas y CNT antes extracción, entonces CI necesidades a ser agregado durante PCR cuantitativa Mezcla preparación. IC añadiendo método después extracción: Diluido CI por 100 veces con ADN diluente y agregar 1 μl diluido CI en

cada PCR cuantitativa Mezcla sistema.

**Este equipo hace no contener ROX Referencia Teñir. Si ROX referencia teñir es necesario para el Real Tiempo PCR amplificadores eso tú son actualmente usando, 50×ROX Referencia Teñir (Cat#10200ES) es recomendado para usar. En este caso, el agregado volumen es 0,8 μl, como mostrado en Mesa 1. Si usando otro

marcas de ROX productos, por favor referirse a su instrucciones para ROX Adición. Si No ROX referencia teñir es requerido, el agregado volumen es 0 microlitros.

Tabla 3 Sistema de mezcla qPCR para M3

*El configuración sistema en Mesa 3 es basado en el premisa eso CI es no agregado a muestras antes extracción, por lo que CI necesidades a ser agregado    durante PCR cuantitativa Mezcla preparación. IC añadiendo método después extracción: Diluido CI por 100 veces con ADN diluente y agregar 1 μl en cada PCR cuantitativa Mezcla

sistema.

**Este equipo hace no contener ROX Referencia Teñir. Si ROX referencia teñir es necesario para el Real Tiempo PCR amplificadores eso tú son actualmente usando, 50×ROX Referencia Teñir (Cat#10200ES) es recomendado para usar. En este caso, el agregado volumen es 0,8 μl, como mostrado en Mesa 1. Si usando otro

marcas de ROX productos, por favor referirse a su instrucciones para ROX Adición. Si No ROX referencia teñir es requerido, el agregado volumen es 0 microlitros.

3) Agregar plantillas

1. Mezcle la mezcla qPCR con suficiente agitación, centrifugue a baja velocidad y recoja el líquido residual de la tapa.

hasta el fondo de el tubo.

1. Añadir 20 μL de mezcla de qPCR en cada tubo/pocillo de reacción. Tenga en cuenta que debe agregar la mezcla de qPCR correspondiente en cada uno.

tubos de muestra y evitar errores de adición.

1. Agregue plantillas a los tubos o pocillos que contenían la mezcla de qPCR. Consulte la Tabla 4 para ver las plantillas que se agregaron.

Mesa 4 plantillas añadiendo

*Recomendamos utilizar el tampón de dilución de ADN (40619-E) como plantilla de NCS para la extracción de ADN.

**El total reacción volumen en cada tubo/pozo es 40 microlitros.

***Cubrir el tubo tapa o el lámina Película. Para evitar conmovedor el fluorescencia señal leyendo por favor llevar cuidado no a marca el tubo tapa o película

o incluso frotar el película repetidamente con a raspador.

****Centrífugo el reacción tubo o lámina brevemente en bajo velocidad después plantillas añadiendo. Después suficiente sacudida y mezclando, repitiendo centrífugo

en bajo velocidad a recolectar el líquido de el tapa o muro a el Abajo. Evitar Burbujas cuando Operación. La base voluntad ser impactado si el mezcla

es no mezclado Bueno, entonces este paso es muy importante a a bien experimento resultado.

4) Configuración de programas qPCR

1. Configuración del archivo de programa

Ejemplo (instrumento del sistema PCR en tiempo real 7500 y software PCR en tiempo real v2.4):

Tipo de instrumento: 7500 (96 pocillos)

Tipo de experimento: cuantificación-curva estándar;

Química: reactivos Taqman®

Velocidad de rampa: estándar (aproximadamente 2 horas para completar una carrera)

1. Configuración del canal de destino

En "Definir Objetivos y "Muestras" de "Lámina Configuración", crear a Objetivo 1 canal (FAM), seleccionar Familia como el reportando grupo de fluorescencia y MGB o ninguno como el enfriamiento fluorescencia grupo. Crear a Objetivo 2 canal (Victoria), seleccionar el reportando fluorescencia grupo como Victoria y el temple fluorescencia grupo como ninguno. En "Asignar Objetivos y "Muestras" de "Lámina Configuración", si No adicional ROX teñir es añadido, seleccionar "ninguno"; Si un adicional ROX es añadido, seleccionar

Rápido.

1. Configuración del programa de amplificación estándar

Tabla 5 Programa de amplificación estándar Ajustes

1. Ajuste de línea base y umbral:

Principio de base ajuste: usar el automático base generalmente. Si necesidad a ajustar en manual, elegir el ciclo antes del crecimiento exponencial período como el ciclo de inicio y evitar la zona de fluctuación de inicial fluorescencia colección. Elija el ciclo que se encuentra 1-2 ciclos antes del Ct de la muestra de amplificación exponencial más temprana como

punto final.

Principio de límite Ajuste: utilice el umbral automático en general. Si necesita ajustar manualmente, el umbral debería ser colocar más alto que el Negativo muestra o el base ruido, es generalmente colocar El umbral en el tarde

etapa de Se necesita una amplificación exponencial, un umbral relativamente independiente y adecuado para cada túnel.

5） Resultado Análisis

1. Juicio de resultado para PCS, NTC y NCS:

Si se agrega IC: la especificación de cada muestra de control debe ser satisfecho en la Tabla 6:

Mesa 6 Resultado juicio de PC, NTC y CN

Si no se agrega IC: cada muestra de control de calidad debe cumplir con la especificación de la columna de señal FAM en la Tabla 6, y no

Es necesario analizar Canal VIC.

1. Sentencia de resultado para TS

Requisito previo: Él es necesario determinar si piezas, NTC y CN Pasó la especificación En la tabla 6 antes de TS Análisis de resultados. Si se aprueba, entonces puede proceder a la Próximo paso. Si no aprobado, el TS resultados puede no ser confiable, y

Es necesario investigar el motivo.

Si se agregó IC: encuentre los resultados correspondientes juicio según la información de resultados de FAM y Victoria En la Tabla 7:

Mesa 7: Resultado juicio de TS (CI agregado)

*Si allá es inhibición para Victoria señal,tratamiento es necesario a eliminar el inhibidores o repetir el prueba.

Si no se agregó IC: encuentre los resultados correspondientes juicio según La información de resultados de FAM en la Tabla 8 , y no es necesario analizarlo Señal VIC.

Mesa 8: Resultado juicio de TS (CI no agregado)

Notas

1. Lea atentamente este manual antes de utilizar este kit. El experimento debe realizarse de manera estandarizada, incluida la manipulación de la muestra, la preparación del sistema de reacción y la adición de la muestra.

2. Mantenga las operaciones de adición de muestras y preparación de reactivos en hielo si es posible.
3. Agite y mezcle bien cada reactivo antes de usar.

4. Por favor, trabaje con bata de laboratorio y guantes desechables. Tu seguridad.
5. Este producto es solo para uso de investigación.