El polibreno (bromuro de hexadimetrina), también conocido como polibreno, es un polímero catiónico que se utiliza habitualmente en experimentos de transfección de ADN con células de mamíferos para mejorar la eficiencia de transfección de liposomas. Se emplea ampliamente en la transfección génica mediada por retrovirus y en la transfección génica mediada por lentivirus. El mecanismo de acción puede implicar la neutralización del ácido siálico en la superficie celular, lo que facilita la adsorción al superar la repulsión electrostática con partículas virales. El polibreno también se reconoce como un anticoagulante (antagonista de la heparina) y se utiliza con frecuencia en la producción de glóbulos rojos agregados de forma no específica. Además, en la secuenciación de proteínas, se ha demostrado que dosis bajas de polibreno mejoran significativamente la degradación de péptidos en el análisis de secuenciación automatizada. La adición de polibreno a las membranas de PVDF también puede mejorar la afinidad de la membrana.

Especificación

El producto se presenta en forma de solución y el polvo se reconstituye en NaCl al 0,9 % para formar una solución de 10 mg/ml, que luego se esteriliza utilizando un filtro de 0,22 μm. Normalmente se diluye en una proporción de 1:1000-1:2000 para su uso, con proporciones de dilución específicas según el tipo de célula, como se describe en la literatura pertinente.

Envío y almacenamiento

Se recomienda el transporte y almacenamiento a -20 ºC, con una vida útil de 2 años. Se aconseja alicuotar y almacenar para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.

Precauciones:

1. Use ropa de laboratorio y guantes desechables para su seguridad y salud.

2. Este producto es sólo para fines de investigación.

Pasos operativos

(como referencia, las concentraciones específicas pueden variar, consulte la literatura pertinente):

Nota: El polibreno puede presentar una toxicidad significativa para ciertas células (como neuronas terminalmente diferenciadas, células DC) y se recomienda una prueba de toxicidad para el uso inicial.

Experimento 1: Infección retroviral

1. Preparación de la reserva de retrovirus recombinante: Cultivar células que contengan una monocapa de células empaquetadoras de retrovirus de transfección en una placa de 100 mm con 5 mL de medio de crecimiento (5% de suero). Después de 24 horas, retirar el medio de cultivo y filtrarlo a través de un filtro de 0,45 μm.

2. Cultivo de células para infección: En una placa de 100 mm, agregue 10 mL de medio de crecimiento completo con una densidad celular de 5×10⁵ por plato.

3. Infección viral: después de 24 horas de cultivo celular, retirar el medio de cultivo completo. Infectar las células con 2 ml de sobrenadante viral que contenga polibreno (concentración final: 5-10 μg/ml) a 37 °C durante 3-6 horas.

4. Recolección de partículas virales: agregar 8 ml de medio de cultivo completo. Después de 2-3 días de cultivo, recolectar el medio de cultivo para obtener partículas virales.

Experimento 2: Transfección

1. Cultivar células en medio de crecimiento completo con una densidad celular de aproximadamente el 50%.

2. Después de 18-24 horas de cultivo celular, prepare una mezcla de medio de cultivo de ADN y polibreno. Agregue medio de cultivo completo (2 ml para una placa de 60 mm, 3 ml para una placa de 100 mm) y precaliente a 37 °C. Mezcle suavemente 10 ng~10 µg de plásmido. Agregue Polybrene hasta alcanzar una concentración final de 5-10 μg/mL. Mezcle suavemente. Cada componente debe agregarse en el orden especificado.

3. Retirar el medio de cultivo y añadir la solución de polibreno y medio de crecimiento de ADN a las células a 37 °C durante 6-20 horas. Mezclar suavemente cada 1,5 horas durante las primeras 6 horas de cultivo celular.

4. Retirar la solución de polibreno, el medio de crecimiento de ADN. Cubrir las células con una solución de choque DMSO (DMSO al 15 % en HBSS 1×).Agite suavemente la placa de cultivo durante 10 segundos cada vez que agregue la solución para garantizar una distribución uniforme. Incube las células a 37 °C durante 4 minutos.

5. Retire inmediatamente la solución de choque de DMSO y lave suavemente las células dos veces con medio de cultivo completo. Para una placa de 60 mm, lave con 5 ml de medio de cultivo cada vez, y para una placa de 100 mm, lave con 10 ml de medio de cultivo cada vez.

6. Agregue medio de crecimiento completo a las celdas.

7. Expresión de proteínas: después de 24 a 72 horas de cultivo, recolecte células para analizar la expresión de proteínas según sea necesario.

Selección de células: Después de 24 a 72 horas de cultivo, según el estado de las células, cambie a medio de selección nuevo y continúe con la selección de células.