El reactivo de transfección de polietilenimina linealizada PEI 25000 es un polímero catiónico altamente cargado que se une fácilmente a las moléculas de ácido nucleico con carga negativa, forma un complejo y permite que el complejo ingrese a la célula. El reactivo de transfección es un reactivo de transfección transitorio con baja citotoxicidad, alta eficiencia de transfección y alta eficiencia de expresión génica en células como HEK293 y CHO. Se ha verificado que el reactivo de transfección PEI lineal es ampliamente aplicable a una variedad de líneas celulares que incluyen HEK-293, HEK293T, CHO-K1, COS-1, COS-7, NIH/3T3, Sf9, HepG2 y células Hela, etc. El reactivo es compatible con medios que contienen suero y puede introducir de manera eficiente ácidos nucleicos en las células.

Especificación

Envío y almacenamiento

El producto se envía a temperatura ambiente y el polvo se puede almacenar a 2-8 ºC durante dos años. La solución madre se almacena a 2-8 ºC durante 3 meses.

Precauciones


1) Una vez que la solución de PEI preparada se saca de la temperatura de -20 ºC y se descongela, se puede conservar en un refrigerador a 4 ºC y no se debe volver a congelar.

2) Para la mayoría de las células, 3,0 μL de reactivo de transfección PEI por 1 μg de ADN pueden lograr una alta eficiencia de transfección. También puede intentar usar un volumen de 1,5 a 4 μL de reactivo de transfección PEI lineal por 1 μg de ADN para la optimización.

3) Para su seguridad y salud, utilice bata de laboratorio, guantes desechables y campana extractora de humos durante la operación.

4) Este producto es solo para fines de investigación científica, no para uso humano.

Preparación de la solución madre (1 mg/mL)


1. Materiales

PEI 25000, agua Milli-Q®/agua para inyección (WFI) o agua de grado biológico similar, ácido clorhídrico (HCl) 12 mol/L, hidróxido de sodio (NaOH) 10 mol/L, filtro estéril al vacío de PES desechable de 0,1~0,2 μm, botella de almacenamiento estéril de HDPE o polipropileno.

2. Prepare la solución madre (1 mg/mL)

1) En un vaso de precipitados de vidrio de 1 L, agregue 1 g de polvo PEI 25000 en 900 mL de agua ultrapura Milli-Q® u otra agua biológica equivalente y agite uniformemente en un agitador magnético para producir un pequeño vórtice.

2) Agregue ácido clorhídrico (12 mol/L) gota a gota mientras agita para ajustar el pH hasta que sea <2,0.

3) Cubra la parte superior del vaso y revuelva durante 3 horas hasta que se disuelva completamente; mantenga el pH < 2,0 durante todo el proceso.

【Nota】: Puede haber algunas pequeñas partículas fibrosas que no se puedan disolver, lo cual es un fenómeno normal.

4) Agregue NaOH (10 mol/L) gota a gota mientras revuelve para ajustar el pH hasta que alcance 6,9 ​​~ 7,1.

5) Transfiera la solución a un cilindro graduado y agregue agua hasta completar 1 L.

6) Filtrar y esterilizar con un filtro de vacío PES desechable de 0,1-0,2 µm para obtener una solución madre de 1 mg/mL.

7) Alicuotar según sea necesario y almacenar a -20 °C, estable durante 1 año.

【Nota】: Después de descongelar nuevamente la solución de almacenamiento, se puede almacenar a 4 °C y es estable durante 2 semanas, pero no se debe volver a congelar.

Procedimiento de transfección (tomando como ejemplo una placa de 6 pocillos)


1. Inoculación de células: para mejorar la eficiencia de la transfección, se recomienda inocular las células un día antes de la transfección, y la densidad celular en el momento de la transfección es preferiblemente del 70% ~ 80%.

2. Prepare el complejo ADN-PEI: Prepare el complejo de reactivo de transfección de ácido nucleico ADN-PEI de acuerdo con el siguiente sistema:

1) Para cada pocillo de células, diluya 2 μg de ADN objetivo con 100 μL de medio sin suero y mezcle bien para formar una dilución de ADN.

[Nota]: Se recomienda Opti-MEM o ddH2O como diluyente sin suero.

2) Agregue inmediatamente 5 μL de reactivo de transfección PEI 25000 a 100 μL de diluyente de ADN, agite durante 10 segundos y mezcle bien.

3) Incubar a temperatura ambiente durante 10 a 25 minutos para formar el complejo de reactivo de transfección de ácido nucleico catiónico ADN-PEI.

3. Células transfectadas:

1) Durante la formación del complejo, retire el medio de crecimiento celular y agregue 2 ml de medio completo fresco precalentado a cada pocillo.

2) Agregue 100 μL de complejo de ácido nucleico ADN-PEI-PEI directamente a las células, agite la placa de cultivo y mezcle suavemente.

3) Cultivar en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2 y la expresión del transgén se puede detectar tan pronto como 7 horas después de la transfección. Determine usted mismo el tiempo de prueba adecuado.

4. Cribado con rotación constante (opcional)

24 h después de la transfección, las células se subcultivaron en un medio de crecimiento nuevo (diluyendo las células más de 10 veces) y se incubaron durante la noche a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2. Al día siguiente, se añadió un fármaco de detección que coincidía con el gen de resistencia a la transfección. Los clones resistentes a los fármacos se pueden detectar en aproximadamente 1 a 2 semanas. Durante este período, el medio de crecimiento que contiene los fármacos de detección debe reemplazarse con frecuencia.

Dosis de transfección para diferentes recipientes de cultivo celular (solo como referencia):