Vero El kit de detección de residuos de ADN de células huésped se utiliza para el análisis cuantitativo del residuo de ADN de células huésped Vero en muestras intermedias, productos semiacabados y terminados de diversos productos biológicos.

Este kit utiliza una sonda fluorescente Taqman y el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que tiene un límite de detección mínimo de nivel fg y puede detectar de manera específica y rápida el ADN residual de células Vero. El kit debe utilizarse junto con el kit de preparación de muestras de ADN residual (n.° de cat. 18461ES).

Producto Componentes

^*IC: Control interno

Envío y almacenamiento

1. Envío en hielo seco. y almacenado a -20°C para 2 año

2. Después de recibir la mercancía, revísela y guárdela inmediatamente en la temperatura de almacenamiento correspondiente.

Precauciones

1. Lea atentamente este manual antes de utilizar este reactivo y el experimento debe estandarizarse, incluida la manipulación de la muestra, la preparación del sistema de reacción y la adición de la muestra.

2. La mejor manera de añadir muestras y preparar soluciones es hacerlo con hielo.

3. Asegúrese de que cada componente esté completamente agitado y centrifugado a baja velocidad antes de su uso.

4. Por su seguridad y salud, utilice bata de laboratorio y guantes desechables durante la operación.

5. ¡Este producto es SÓLO para uso en investigación!

Modelos de instrumentos aplicables

Incluyen, entre otros:

Bio-Rad: Módulo óptico CFX96.

Termo Científico: Peso bruto: 7500 Estudio cuantitativo ABI 5; Paso ABI OnePlus.

Uso de instrucciones

1. Vero Dilución estándar de ADN y preparación de curva estándar

El Vero El control de ADN se diluyó en gradiente utilizando el tampón de dilución de ADN proporcionado en el kit. y la concentración de dilución es 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL, 3 concentración de μg/ml

Vea las instrucciones detalladas a continuación:

1.1 Descongelar el Vero Control de ADN y tampón de dilución de ADN en hielo. Después de descongelar completamente, agite suavemente para mezclar y centrifugue a baja velocidad durante 10 segundos.

1.2 Sacar seis Tubos limpios de 1,5 mL, marcados con 3 ng/μL, ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥.

1.3 Agregue 90 μL de tampón de dilución de ADN y 10 μL de Vero Control de ADN al 1.Tubo de microcentrífuga de 5 mL etiquetado 3 ng/μL y diluir a 3 ng/μL. Mezclar y luego centrifugar durante 10 segundos. Envasar el estándar de ADN diluido en un envase secundario y almacenarlo a corto plazo (no más de 3 meses) a -80 °C. Evitar la congelación y descongelación repetidas.

1.4 Agregue 90 μL de tampón de dilución de ADN al otro tubos, luego siga el procedimiento a continuación para las diluciones seriadas.

[Notas]:

1. Se requieren tres pocillos replicados para cada concentración. El rango de detección es de 3. fg/μL-300 pg/μL y Esta gama se puede ampliar si es necesario.

2. Para reducir el número de repeticiones de congelación y descongelación y evitar la contaminación, se recomienda almacenar el control de ADN en alícuotas a -80°C por primera vez.

3. Una vez descongelado, el tampón de dilución de ADN podría conservarse a 2-8°C Durante 7 días, si no se utiliza durante un tiempo prolongado, conservar a -20 °C.

4. Asegúrese de que la plantilla esté completamente mezclada, agite suavemente la mezcla durante 15 segundos a 1 minuto. para cada dilución de gradiente.

2. Preparación del control de recuperación de extracción (ERC)

Establecer la concentración de Vero ADN en el ERC según sea necesario (la muestra del ERC) se preparó con 3 pg/μL de ADN como ejemplo), de la siguiente manera:

2.1 Agregue 100 μL de muestra de prueba en un tubo limpio de 1,5 mL, luego agregue 10 μL de Vero 3pg/μL Estándar de ADN (③) y mezclar bien, marcado como ERC.

2.2 Realizar la extracción de ADN de la muestra de ERC Junto con las muestras de prueba para preparar el ERC purificado muestra.

3. Preparación de la muestra de control positivo (PCS) (opcional)

Establecer la concentración de Vero ADN en PCS según sea necesario (el PCS se preparó con 3 pg/μL de ADN como ejemplo), de la siguiente manera:

3.1 Agregue 100 μL de Vero 3 pg/μL Estándar de ADN (③) en un tubo limpio de 1,5 ml, luego marcado como PCS.

3.2 Realizar la extracción de ADN de PCS junto con las muestras de prueba para preparar el PCS purificado.

4. Negativo Preparación de la solución de control (NCS)

Establezca el control negativo en el experimento, los pasos de operación específicos son los siguientes:

4.1 Añadir 100 μL matriz de muestra (o tampón de dilución de ADN) en un tubo limpio de 1,5 ml y luego marcado como NCS.

4.2 Realice la extracción de ADN de la muestra de NCS junto con las muestras de prueba para preparar la muestra de NCS purificada.

5. Preparación sin control de plantilla (NTC)

No establecer plantilla En el control del experimento, los pasos específicos de operación son los siguientes:

5.1 NTC no requiere pretratamiento de la muestra y se puede configurar en la etapa de detección de qPCR del contenido de ADN residual.

5.2 La muestra de NTC en cada tubo o pocillo es de 20 microlitros Mezcla (es decir, 16 microlitros Mezcla de qPCR Vero + 4 μL Mezcla de cebadores y sondas Vero + 20 μL Tampón de dilución de ADN. Se recomienda configurar tres pocillos de réplica.

6. Sistema de reacción PCR

[Notas]:

1. Calcule el volumen total de la reacción de PCR mediante el número de reacciones: qPCR Mix = (el número de reacciones + 2) × (16 + 4) μL (incluidas las pérdidas de dos pocillos de reacción). Se recomiendan más de tres réplicas para cada muestra en el experimento.

2. Después de tapar el tubo o sellar la placa, centrifugue el tubo o la placa de reacción a baja velocidad durante 10 segundos. Después de agitar y mezclar lo suficiente durante 5 segundos, repita la centrifugación para recoger el líquido de la tapa o la pared hasta el fondo. Evite que se formen burbujas durante la operación.

Consulte la siguiente tabla para ver la configuración de placa recomendada:

El diseño de la placa incluye: 1 NTC (sin plantilla control), 1 CN (control negativo solución), 6 ETS (curva estándar de 6 concentraciones estándar), 3 TS (muestras de prueba), 3 ERC (control de recuperación de extracción), 1 PCS (muestra de control positivo).Tres pocillos replicados para cada muestra.

7. Pautas de configuración para un instrumento PCR (Método de 2 pasos)

Las siguientes instrucciones se aplican únicamente al instrumento Thermo ABI 7500 qPCR (Versión de software 2.0). Si utiliza un instrumento diferente, consulte la guía del instrumento correspondiente para obtener instrucciones de configuración.

7.1 Generar un nuevo experimento, elegir la plantilla de cuantificación absoluta o definida por el usuario.

7.2 En la interfaz 'Definir' y el panel 'Objetivos', agregue un objetivo y nómbrelo como FAM, elija el reportero como 'FAM' y el extintor como 'ninguno'.

7.3 En el panel "Muestras", agregue toda la información de las muestras una por una. Luego, seleccione los pocillos, elija el objetivo y las muestras correspondientes. Configure la tarea de Vero Estándar de ADN como estándar y asignar los valores 300000, 30000, 3000, 300, 30, 3 (la unidad de concentración de ADN en cada pocillo es fg/μL) en la columna Cantidad y nombre los pocillos STD 1, STD 2, STD 3, STD 4, STD 5, STD 6, correspondientemente. Establezca la tarea de NTC como NTC. Establezca NCS, TS, ERC y PCS como Desconocido y nómbrelos según el diseño de placa anterior. Luego haga clic en Siguiente.

7.4 Configure el programa de amplificación: configure el volumen de reacción en 40 μL.

8. Análisis de los resultados de qPCR

8.1 El sistema proporcionará automáticamente el umbral en el panel Gráfico de amplificación del análisis. El umbral proporcionado por el sistema a veces está demasiado cerca de la línea base, lo que genera una gran diferencia en el Ct entre los pocillos replicados. Puede ajustar manualmente el umbral a una posición adecuada y hacer clic en Analizar. Luego, puede verificar inicialmente si la curva de amplificación es normal en el Gráfico de componentes múltiples.

8.2 En la pestaña Análisis de resultados, revise el gráfico de la curva estándar. Verifique los valores de pendiente, intersección con el eje Y y R2. y Eficiencia. Para una curva estándar normal, R²>0,99; 90%≤Eff%≤110%.

8.3 En el 'Ver tabla de pozos' En el panel Análisis, las concentraciones de cada muestra se muestran en Cantidad, la unidad es fg/μL, las unidades se pueden convertir a pg/μL o pg/mL en el informe del ensayo.

Manuales