El kit de ensayo de especies reactivas de oxígeno utiliza el reactivo permeable a las células 2',7'-diacetato de diclorofluorescina (DCFDA) para evaluar cuantitativamente las especies reactivas de oxígeno en muestras de células vivas. El DCFDA lipofílico no fluorescente atraviesa fácilmente la membrana celular a través de difusión pasiva seguida de desacetilación. El producto desacilado es una 2',7'-diclorofluoresceína (DCHF) sensible a los oxidantes. El DCHF se oxida posteriormente por ROS para formar DCF. El DCF es altamente fluorescente y se detecta mediante espectroscopia de fluorescencia o citometría de flujo con excitación/emisión a 480 nm/525 nm. Rosup, una mezcla de compuestos, es un inductor de ROS y se puede utilizar como control positivo.

Componentes del producto

Envío y almacenamiento

Este kit se envía con una bolsa de hielo. Conservar a -20 °C sin luz durante 1 año. Evitar la congelación y descongelación repetidas.

Método de aplicación

1. Preparación de reactivos
Solución de DCFH-DA: centrifugar brevemente a baja velocidad antes de abrir. Preparar una solución de trabajo de DCFH-DA diluyendo 10 mM de DCFH-DA en medio sin suero para lograr una concentración final de 10 μM.
[Nota]: El DCFH-DA también se puede diluir en medios sin rojo fenol. Utilice una solución de DCFH-DA recién preparada; no se recomienda el almacenamiento a largo plazo del DCFH-DA diluido. La concentración exacta de DCFH-DA necesaria dependerá de la línea celular que se utilice, pero un rango de inicio general sería de 10 a 50 μM. Para ciertas células, si la fluorescencia del control negativo (sin sonda de DCFH-DA) es muy fuerte, diluya el DCFH-DA a 2-5 μM y acorte el tiempo de incubación. adecuadamente.
Solución de Rosup: Prepare una solución de trabajo de Rosup 100 µM diluyendo una solución madre de Rosup 100 mM en un medio sin suero. En general, la incubación con Rosup a 37 ℃ durante 30 min-4 h en la oscuridad puede aumentar significativamente las ROS.
[Nota]: El tiempo de incubación de Rosup dependerá de la sensibilidad de la línea celular. Por ejemplo, 30 min para Hela y 1,5 h para MRC5. Si no se observa un aumento de ROS en 30 minutos, se puede aumentar el tiempo de inducción o la concentración según corresponda. Si el aumento de ROS es demasiado rápido, se puede reducir el tiempo de inducción o la concentración según corresponda.
Medicamentos: Preparar el medicamento de interés en medio completo con 10% FBS u otra solución apropiada hasta la concentración deseada.
2. Protocolo recomendado para células adherentes
a) Preparación de células: Cultivar células adherentes en un medio de cultivo celular estándar el día antes del experimento para que la confluencia celular alcance el 70% en el momento del experimento.
b) Inducción con fármacos: Retirar el medio. Cubrir cada pocillo con fármacos diluidos sin suero previamente preparados e incubar durante el tiempo deseado a 37 °C en la oscuridad.
c) (Opcional) Control positivo: Cubra el pocillo de control positivo con la solución Rosup previamente preparada e incube durante el tiempo deseado a 37 °C en la oscuridad.
[Nota]: Para las células con un tiempo de estimulación corto (generalmente dentro de las 2 horas), la sonda también se puede cargar primero y luego agregar Rosup o un fármaco de interés.
d) Carga de la sonda ROS: Retire todo el medio y lave las células con medio sin suero 1 o 2 veces. Cubra cada pocillo con la solución DCFH-DA previamente preparada. Incube a 37 ℃ durante 30 minutos en la oscuridad.
e) Retire el medio y lave las células 1-2 veces con medio sin suero para eliminar el DCFH-DA libre.
3. Protocolo recomendado para células en suspensión
a) Preparación de células: Cultivar células en suspensión hasta aproximadamente 1,5 × 105 células por pocillo el día del experimento.
b) Inducción de fármacos: Recoger las células en un tubo cónico mediante centrifugación y resuspenderlas en una cantidad apropiada de fármaco diluido sin suero previamente preparado e incubar durante el tiempo deseado a 37°C en la oscuridad.
c) (Opcional) Control positivo: Resuspender las células de control positivo con la solución Rosup previamente preparada e incubar durante el tiempo deseado a 37°C en la oscuridad.
d) Carga de la sonda de ROS: Recoger en un tubo nuevo y lavar las células mediante centrifugación dos veces en PBS. Resuspender las células con la solución DCFH-DA previamente preparada con una densidad celular de 1×106-2×107/mL. Luego incubar a 37℃ durante 30 min en la oscuridad. Invertir el tubo cada 3-5 minutos para asegurar el contacto completo entre la sonda y las células.
[Nota]: La densidad celular debe ajustarse de acuerdo con el método de detección posterior. Por ejemplo, para la citometría de flujo, la cantidad de células en un solo tubo no debe ser inferior a 104/ml ni superior a 106/ml.
e) Recolectar y lavar las células mediante centrifugación dos veces con medio sin suero para eliminar el DCFH-DA libre.
4. Detección de fluorescencia y análisis de datos
Medición mediante microscopía de fluorescencia: Realice una microscopía de células vivas con un conjunto de filtros adecuado para fluoresceína (FITC) utilizando un microscopio de fluorescencia. Califique visualmente las células en función del brillo y compárelas con el control y las muestras o utilice métodos de análisis de imágenes para comparar señales entre fotografías digitales de células.
Medición por citometría de flujo: las células adherentes se deben recolectar con tripsina para preparar una suspensión de células individuales; para las células en suspensión, las células se recolectan directamente. Lo ideal es analizar 10 000 células por condición experimental. Las células no deben ser demasiado densas durante el experimento (<1 ×106 células/ml). Excluya los desechos y aísle la población celular de interés mediante la selección de grupos. Con la intensidad de fluorescencia media, determine el cambio de pliegue entre las muestras de control y las tratadas con Ex/Em = 480/525 nm.
Medición de microplacas fluorescentes: mida la placa inmediatamente en un lector de placas de fluorescencia a Ex/Em = 480/525 nm en modo de punto final en presencia de medio. Reste las lecturas del blanco de todas las mediciones y determine el cambio de factor a partir del control de ensayo.

Precauciones

1. Lave las células después de incubarlas con DCFH-DA para reducir el ruido de fondo.
2. Se recomienda medir la fluorescencia lo antes posible después de la incubación para evitar posibles errores.
3. Para su seguridad y salud, utilice bata de laboratorio y guantes desechables durante la operación.
4. ¡Solo para uso en investigación!