La puromicina es un antibiótico aminoglucósido producido por fermentación y metabolismo de Streptomyces alboniger, que mata bacterias grampositivas y varias células animales e insectos al inhibir la síntesis de proteínas. La puromicina es eficaz contra E. coli en algunos casos. El mecanismo es que puromicina es un análogo del extremo 3' de las moléculas de aminoil-TrNA, que puede unirse al sitio A del ribosoma e incorporarse a la cadena peptídica extendida. Una vez que la puromicina se une al sitio A, no participará en ninguna reacción posterior, lo que da como resultado la terminación prematura de la síntesis de proteínas y la liberación de polipéptidos inmaduros que contienen puromicina en el extremo C.

El gen pac que se encuentra en la cepa productora de puromicina Streptomyces alboniger codifica una N-acetiltransferasa de puromicina (PAC) que confiere resistencia a la puromicina. Esta propiedad se utiliza ahora comúnmente para analizar líneas celulares de mamíferos transfectadas de manera estable que portan plásmidos del gen pac.

La aplicación general de la puromicina en la selección de transfecciones celulares estables está relacionada con las características de los vectores lentivirales. La mayoría de los vectores lentivirales comerciales en la actualidad llevan el gen pac. En algunos casos específicos, la puromicina también se puede utilizar para detectar la transformación de cepas de E. coli que llevan el plásmido del gen pac.

Este producto es adecuado para el cultivo celular, la concentración de trabajo común es de 1 a 10 µg/mL.

Además, la compañía Yeasen también ofrece puromicina (cat. n.° 60209ES) en forma de solución, que se encuentra en un estado diferente pero tiene la misma función.

Características

Pureza≥98%

Aplicaciones

Adecuado para cultivo celular.

SCepas de células de mamíferos transfectadas de forma estable y específicas que portan plásmidos que contienen el gen pac

Pantalla el Cepas de E. coli transformadas que portan el plásmido del gen pac

Presupuesto

Componentes

Envío y almacenamiento

El paguromicina dihidrocloruro Los productos deben almacenarse a -15 ℃. ~-25℃ para 2 años.

Instrucciones

1. Concentración de trabajo sugerida

Células de mamíferos: 1-10 micrasg/mL, la concentración óptima debe determinarse mediante la curva de eliminación.

Escherichia coli: se utilizó medio de agar LB para examinar Escherichia coli transformada de manera estable con el gen pac a una concentración de 125 micrasconcentración/volumen de la muestra.

Nota: La detección de cepas estables de E. coli mediante puromicina requiere un ajuste preciso del pH.

Concentraciones recomendadas de puromicina clorhidrato

2. Método de disolución

Disolver la puromicina en agua destilada para preparar una solución madre de 50 mg/ml. Después de la esterilización por filtración a través de una solución de 0,22 micrasFiltrar por membrana, alicuotar y almacenar a una temperatura de -25 a -15℃Alternativamente, se puede disolver en metanol para preparar una solución de almacenamiento de 10 mg/mL.

3. Determinación de puromicina curva de muerte (tomando como ejemplo la transfección de shRNA o la transducción de lentivirus)

La concentración de cribado efectiva de puromicina está relacionada con el tipo de célula, el estado de crecimiento, la densidad celular, el metabolismo celular y la posición en el ciclo celular. Para detectar líneas celulares de shRNA que expresen de manera estable, es fundamental determinar la concentración mínima de puromicina que mata las células no transfectadas/transducidas. Se recomienda que los clientes que realicen experimentos por primera vez establezcan una curva de muerte adecuada para su propio sistema experimental.

1) Día 1: La placa de 24 pocillos se siembra a una densidad de 5-8×104 células/pocillo y se colocan en placa una cantidad suficiente de pocillos para experimentos de gradiente posteriores. Las células se incubaron durante la noche a 37℃.

2) Día 2: A) Preparar el medio de detección: medio fresco que contenga diferentes concentraciones de puromicina (como 0-15 micrasg/mL, al menos 5 gradientes); B) Reemplazar el medio de detección recién preparado en las células después de la incubación durante la noche; Luego, las células se incuban a 37℃.

3) Día 4: Reemplazar con medio de selección fresco y observar la viabilidad celular.

4) Dependiendo del estado de crecimiento de las células, cambiar a medio de selección nuevo cada 2-3 días.

5) Las células fueron monitoreadas diariamente para observar la tasa de células viables y determinar la concentración más baja de fármaco efectiva para matar las células no transfectadas o todas las células no transducidas dentro de los 4 a 6 días posteriores al inicio de la detección de antibióticos.

4. Detección de líneas celulares de mamíferos transfectadas de forma estable

Después de la transfección del plásmido que contiene el gen pac, las células se propagaron en un medio que contenía puromicina para seleccionar transfectantes estables.

1) 48 h después de la transfección, las células (originales o diluidas) se cultivan en medio fresco que contiene una concentración adecuada de puromicina.

Nota: Los antibióticos son más eficaces cuando las células se dividen activamente. Si las células son demasiado densas, la eficacia de los antibióticos se reducirá significativamente. Es mejor sembrar las células a una densidad no superior al 25 %.

2) Retirar y sustituir el medio de cultivo que contiene puromicina Cada 2-3 días.

3) Los focos formados por células se evalúan 7 días después del cribado. Las lesiones pueden requerir una semana adicional o más, según la línea celular huésped y la eficiencia del cribado por transfección.

Nota: Observe el estado de crecimiento celular todos los días. La detección de puromicina requiere al menos 48 horas y el período de detección de la concentración efectiva de puromicina es generalmente de 3 a 10 días.

4) Transfiera y coloque de 5 a 10 clones resistentes en una placa Petri de 35 mm y continúe cultivando con medio de selección durante 7 días. Este cultivo de enriquecimiento es para preparar un futuro experimento de citotoxicidad..

Documentos:

Hoja de datos de seguridad

60210_MSDS_HB220421_ES.pdf

Manuales

60210_Manual_HB250114_ES.pdf

Citas y referencias:

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