Descripción
El sulfato de G418, también conocido como sulfato de geneticina, es un antibiótico aminoglucósido estructuralmente similar a la gentamicina B1. Interfiere en la síntesis de proteínas al unirse al ribosoma 80s y bloquear los pasos de elongación. El sulfato de G418 es tóxico tanto para las células procariotas como para las eucariotas, incluidas las bacterias, las levaduras, las células vegetales y mamíferas superiores, así como para los protozoos y los gusanos. El gen de resistencia (principalmente neo), ubicado en el transposón Tn601 (903) o Tn5, se deriva de bacterias, pero se puede expresar en células eucariotas. El gen de resistencia se puede introducir en las células a través de técnicas de recombinación genética para obtener la resistencia de G418, que podría usarse para examinar y mantener el cultivo de células procariotas o eucariotas que portan el gen de resistencia.
En las células de mamíferos, neo codifica la expresión de la aminoglucósido 3' -fosfotransferasa (APH (3') II) después de integrarse en el genoma eucariota. Esta enzima inactiva el antibiótico modificando covalentemente la función amino o hidroxilo de G418 e inhibiendo la interacción antibiótico-ribosoma, lo que confiere a la célula resistencia a G418. En los experimentos de selección de líneas celulares estables, se deben establecer las curvas de eliminación (curvas dosis-respuesta) para determinar la concentración mínima efectiva para eliminar las células no resistentes.
En las células vegetales, la resistencia se puede obtener mediante la transfección del plásmido resistente al gen nptII. El gen nptII también codifica la aminoglucósido fosfotransferasa, una enzima que inactiva varios antibióticos, entre ellos G418, kanamicina y palomicina.
Características
Pureza≥98%
Producción estandarizada, utilizando el modo de producción en masa de fábrica.
Amplia gama de aplicaciones, que se pueden utilizar en los campos de la biología molecular y la investigación experimental bioquímica del cultivo de tejidos.
La plataforma de cooperación cubre toda la
Para garantizar la estabilidad de la calidad del producto, la diferencia entre lotes se controla dentro del 1%.
Aplicaciones
Cribado de líneas celulares transfectadas de forma estable
Presupuesto
| NÚMERO CAS | 108321-42-2 |
| Fórmula molecular | do20yo40norte4Oh10·2 horas2ENTONCES4 |
| Peso molecular | 692.7 g/mol |
| Pureza | ≥98% |
| Potencia（anhidro） | > 700 U/mg |
| Apariencia | Polvo blanco o blanco claro |
| Solubilidad | Soluble en H2Oh |
| Estructura |
|
Componentes
| Componentes No. | Nombre | 60220ES03 | 60220ES08 |
| 60220 | Sulfato G418 (geneticina) | 1 gramo | 5 gramos |
Envío y almacenamiento
El Sulfato G418 (geneticina) Los productos deben almacenarse a -15 ℃. ~-25℃ para 3 años.
Instrucciones
1. Preparación de solución de almacenamiento G418 (50 mg/mL, concentración activa)
1) Conversión de unidades de actividad
La conversión se realizó según esta fórmula: (1000/A0) ×A1=A2
A0: Valor de potencia de G418, que varía de un lote a otro. Consulte el informe de calidad del lote o la etiqueta del frasco.
A1: La concentración de G418 activo que desea.
A2: La concentración real de G418.
Por ejemplo, si el valor de actividad de G418 del lote es 750 U/mg y la concentración activa de G418 es 50 mg/mL, la concentración real de polvo que se debe preparar es 1000/750×50 mg/mL=66,67 mg/mL. Si se preparan 10 mL de solución de almacenamiento de G418 (concentración activa, 50 mg/mL), se deben pesar 666,7 mg de polvo.
2) Esterilización y conservación
Pesar el polvo real obtenido mediante la conversión anterior y agregar 10 ml de agua desionizada estéril para disolverlo completamente.
Humedezca previamente el filtro de aguja de 0,22 μm con 5 ml de agua desionizada estéril y luego esterilice la solución G418 mediante filtración.Alicuota la solución G418 esterilizada y almacénala a -20℃.
Nota: ① No filtre la solución turbia, ya que la solución no se ha disuelto completamente, el proceso de filtración provocará pérdida de fármaco y reducirá la actividad de la solución final. ② No se recomienda utilizar medios de cultivo, soluciones de fosfato o disolventes orgánicos para preparar la solución de almacenamiento.
2. Concentración de detección de uso común
En general, se requiere inicialmente una concentración alta de G418 para la detección de los transformantes y se utiliza una concentración baja para mantener el cultivo. Las condiciones de crecimiento, los tipos de células y otros factores ambientales pueden afectar la dosis efectiva de G418, por lo que se recomienda determinar la concentración óptima de detección a través de la curva de eliminación (curva dosis-respuesta).
Generalmente, el rango de detección de células de mamíferos es de 200 a 2000 μg/mL, células vegetales: 10 a 100 μg/mL, células de levadura: 500 a 1000 μg/mL.
Datos experimentales de líneas celulares
| Tipo de célula | Activar la concentración | Solicitud | Referencias |
| Dictyostelio | a) 10 μg/ml b) 30 μg/ml | a) Cultivo en medio b) Cultivo en bacterias liofilizadas | Hirth y col. Actas de la Academia Nacional de Ciencias, v. 79, 7356-7360 (1982). |
| Especies de mamíferos | a) 400-1000 μg/ml b) 200 μg/mL | a) Se utiliza para la detección b) Se utiliza para mantenimiento | Canaani y Berg, Actas de la Academia Nacional de Ciencias, v. 79, 5166-5170 (1982). |
| Planta | a) 25-50 μg/ml b) 10 μg/ml | a) Se utiliza para la detección b) Se utiliza para mantenimiento | Ursic, et. al., Bioquímica, Biofísica, Res. Comm., v. 101:3, 1031-1037 (1981). |
| Levadura | a) 500 μg/mL b) 125-200 μg/ml | a) Se utiliza para la detección b) Se utiliza para mantenimiento | Jiménez y Davies, Naturaleza, v. 287, 869-871 (1980). |
| Bacteria | 16 μg/ml | Se utiliza para la detección | Waitz y col. Agentes antimicrobianos, quimioterapéuticos v. 6:5, 579-581 (1974). |
3. Establecimiento de la curva de matanza
Nota: Para detectar líneas celulares con expresión estable de proteínas diana, es necesario determinar la concentración mínima de antibióticos que puede matar a las células huésped no transfectadas. Esto se puede lograr estableciendo una curva de muerte (curva dosis-respuesta). Se deben seleccionar al menos seis concentraciones. El G418 es más activo cuando se trata a células mitóticas, por lo que las células deben cultivarse durante un período de tiempo antes de agregar G418.
1) Día 1: Las células no transformadas se colocan en una placa de cultivo adecuada con una densidad celular del 20-25 % a 37 ℃ y se cultivan durante la noche en CO.2;
Nota: Para las células que requieren mayor densidad para detectar viabilidad, se puede aumentar la cantidad de inoculación.
2) Establezca el gradiente de concentración de G418 dentro del rango apropiado según el tipo de célula. Las células de mamíferos se pueden establecer en 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL.
3) Día 2: Retirar el medio viejo y reemplazarlo por un medio recién preparado que contenga la concentración correspondiente de fármacos. Realizar tres experimentos paralelos para cada concentración.
4) Luego reemplace con medio nuevo que contenga G418 cada 3-4 días.
5) Los recuentos de células vivas se realizan en un ciclo fijo (por ejemplo, cada 2 días) para determinar la concentración adecuada. Elija la concentración mínima, que mata la mayoría de las células en un número ideal de días (generalmente 7-10 días), como la concentración de trabajo para la detección de células de transfección estable.
4. Cribado de células transfectadas estables
1) 48 h después de la transfección, se utilizó medio de cultivo G418 que contenía la concentración adecuada para el subcultivo (subcultivo directo o subcultivo diluido).
Nota: Para obtener buenos resultados de detección, se recomienda diluir las células no más del 25 % de abundancia.
2) Cambiar el medio de cribado que contiene el fármaco cada 3-4 días.
3) Medir la formación de colonias celulares después de 7 días de detección. La formación de colonias puede tardar una semana o más, dependiendo del tipo de célula huésped, la transfección y la eficacia de la detección.
4) Se seleccionaron 5-10 clones resistentes y se transfirieron a placas de cultivo celular de 35 mm, y se cultivaron con medio de detección que contenía fármaco durante 7 días.
5) Reemplazar con medio normal.
Documentos:
Hoja de datos de seguridad
Manuales
Cifras
Figura 1.Prueba de estabilidad y validación de concentración efectiva de genomicina entre diferentes lotes
Cepa experimental: E. coli
G69 y G99 son dos lotes diferentes
Se determinó que la concentración de uso de genomicina era de 8 mg/L, 12 mg/L y 16 mg/L respectivamente, y que la concentración mínima efectiva era de 16 mg/L, lo que inhibía perfectamente el crecimiento de diversas bacterias. El rendimiento de los dos lotes fue consistente.
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