La higromicina B, un antibiótico aminoglucósido sintetizado por Streptomyces hygroscopicus, inhibe la síntesis de proteínas al interferir con la translocación ribosómica 70S e inducir una lectura errónea de la plantilla de ARNm, matando así a procariotas (como bacterias), eucariotas (como levaduras y hongos) y eucariotas mamíferos superiores.

Los genes de resistencia a la higromicina (hyg o hph) derivados de Escherichia coli codifican la fosfotransferasa de la higromicina B, que desintoxica la higromicina B en un producto fosforilado no biológicamente activo, lo que la convierte en un excelente marcador selectivo para la detección y el cultivo de células procariotas o eucariotas transfectadas con éxito con genes de resistencia a la higromicina. Además, debido a los diferentes modos de acción, la higromicina B se utiliza a menudo en combinación con G418 o Blasticidina S para la selección de líneas celulares de doble resistencia. La higromicina B también se puede utilizar como agente antiviral porque penetra selectivamente en las células con mayor permeabilidad de la membrana debido a la infección viral e inhibe la traducción. También puede actuar como repelente de insectos si se mezcla con el alimento para animales.

Este producto es una solución estéril de higromicina B (50 mg/mL en tampón PBS) y se puede diluir directamente para su uso con un medio de cultivo.

Características

Producción estandarizada, utilizando el modo de producción en masa de fábrica.

Aplicaciones

Estéril

Cribado de líneas celulares transfectadas de forma estable

Presupuesto

Componentes

Envío y almacenamiento

El Higromicina B (50 mg/ml) Los productos deben almacenarse en 2℃ ~ 8℃ para 2 años.

Instrucciones

1. Concentración de detección de uso común

La concentración de trabajo de higromicina B utilizada para detectar cepas de transferencia estable debe variar según el tipo de célula, el medio, las condiciones de crecimiento y la tasa metabólica celular, con concentraciones recomendadas de 50 a 1000 micrasg/mL. Para el primer sistema experimental, se recomienda una curva de eliminación (curva de eliminación), la curva de reactividad de la dosis, para determinar la concentración de detección óptima.

En general, células de mamíferos: 50-500 micrasg/mL; Células bacterianas/vegetales: 20-200 micrasg/mL; Hongos: 300-1000 micrasconcentración/volumen de la muestra.

2. Establecimiento de la curva de matanza

Nota: Para seleccionar líneas celulares estables, es necesario determinar la concentración mínima de antibióticos capaces de matar células hospedadoras no transfectadas. Esto se puede lograr estableciendo una curva de muerte (curva dosis-respuesta). Se deben disponer al menos cinco concentraciones.

1) Día 1: Las células no transformadas se colocan en una placa de cultivo adecuada a una densidad celular del 20-25% y se cultivan durante la noche.

Nota: La cantidad de células de inoculación se puede aumentar para las células que requieren mayor densidad para detectar vitalidad.

2) Establezca el gradiente de concentración dentro del rango apropiado según el tipo de célula. En el caso de las células de mamíferos, se pueden establecer 50, 100, 250, 500, 750, 1000. micrasg/mL. Diluir la solución de higromicina B 1:10 con agua desionizada o tampón PBS hasta 5 mg/mL. Y luego diluir la solución hasta la concentración de trabajo correspondiente según la siguiente tabla.

3) Día 2: Reemplazar con un medio recién preparado que contenga la concentración correspondiente del fármaco. Realizar tres muestras paralelas para cada concentración.

4) Luego reemplace con medio fresco que contenga medicamento cada 3-4 días.

5) Realice recuentos de células vivas a intervalos fijos (por ejemplo, cada 2 días) para determinar la concentración adecuada que inhiba el crecimiento de las células no transfectadas. Seleccione la concentración más baja que pueda matar a la gran mayoría de las células en el número ideal de días (normalmente, entre 7 y 10 días) como concentración de trabajo para la selección estable de transfectantes.

3. Detección de líneas celulares de mamíferos transfectadas de forma estable

1) 48 h después de la transfección, las células fueron subcultivadas en un medio de detección que contenía higromicina B en una concentración adecuada (directa o diluida).

Nota: Los antibióticos funcionan mejor en células que se dividen activamente. Si las células son demasiado densas, el antibiótico no las matará. Divida las células de modo que no haya más de un 25 % de confluencia.

2) Cambie el medio de cribado cada 3-4 días.

3) Medir la formación de colonias celulares después de 7 días de detección. La formación de colonias puede tardar una semana o más, dependiendo del tipo de célula huésped, la transfección y la eficacia de la detección.

4) Seleccionar de 5 a 10 clones resistentes y transferirlos a placas de cultivo celular de 35 mm y cultivarlos con un medio de detección que contenga el fármaco durante 7 días.

5) Reemplazar con medio fresco sin drogas para el cultivo.

Documentos:

Hoja de datos de seguridad

60224_MSDS_HB220420_ES.pdf

Manuales

60224_Manual_HB250115_ES.pdf