Descripción
La aureobasidina A, también conocida como AbA, basifungina o breomicina A, es un antibiótico peptídico de éster cíclico aislado del hongo filamentoso Aureobasidium Pullulans No. R106. Tiene una fuerte capacidad antifúngica y es un inhibidor de la ceramida sintasa fosforilada por inositol AUR1. Es tóxica para la levadura incluso en concentraciones más bajas (0,1-0,5 μg/ml). Las especies de hongos susceptibles a la Aureobasidin A incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans y A. niger. Las especies de hongos susceptibles a ella incluyen levadura dental (Saccharomyces cerevisiae), mijo Schizaccharomyces (Schizosaccharomyces pombe), Candida glabrata (Candida glabrata), Aspergillus nidulans (Aspergillus nidulans) y Aspergillus niger (A. niger.). El mecanismo de acción es que la Aureobasidin A inhibe la actividad de la inositol fosforamidita (inositol fosforilceramida, IPC) sintasa, de la que depende el crecimiento del hongo, e interfiere con la síntesis de esfingolípidos, matando así aún más a la cepa. Se han estudiado más genes que codifican sintasas de IPC como el gen AUR 1 de Saccharomyces cerevisiae y el gen AURA de A. sinensis, que tiene homología. Al silenciar estos genes codificantes, las cepas se vuelven resistentes a la aureobasidina A, como el gen AUR 1-C.
La aureobasidina A es muy adecuada como marcador de selección de fármacos para la detección de clones positivos. La resistencia a la aureobasidina A también es un indicador ideal en estudios de híbridos simples y dobles en levaduras. Este producto es una solución de aureobasidina A disuelta en metanol con una concentración de 1 mg/mL.
Características
Pureza≥97%
Producción estandarizada, utilizando el modo de producción en masa de fábrica.
Aplicaciones
Estudios de dos híbridos de levadura
Estudios de un híbrido de levadura
Marcador riguroso de selección de fármacos en levaduras
La resistencia a la aureobasidina A es un reportero ideal para estudios de hibridación de levaduras
Presupuesto
| N.º CAS | 127785-64-2 |
| Fórmula molecular | do60yo92norte8Oh11 |
| Peso molecular | 1101,42 g/mol |
| Apariencia | solución liquida |
| Pureza | ≥97% |
| Solubilidad | El polvo es soluble en DMSO y metanol (0.5-10 mg/mL); Insoluble en agua |
| Estructura |
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Componentes
| Componentes No. | Nombre | 60231ES03 | 60231ES08 | 60231ES10 |
| 60231 | Aureobasidina A（AbA） | 1 mg (1 mg/ml) | 5×1 mg (1 mg/ml) | 10×1 mg (1 mg/ml) |
Envío y almacenamiento
El Aureobasidina A（AbA） Los productos deben almacenarse en -15℃ ~ -25℃ para 2 años.
Instrucciones
1. Concentración en el trabajo
Consulte la literatura relevante para conocer la concentración específica y explore y optimice según sus propias condiciones experimentales (como propósito experimental, tipo de célula, características del cultivo, etc.).
2. Experimento celular (experimento in vitro)
La aureobasidina A detiene el crecimiento de las células de levadura a través de la intoxicación por ceramidas y la privación de inositolfosforilceramidas esenciales.[1].
Se sintetizaron repeticiones triples en tándem de cada motivo CArG-box. Todos los fragmentos de ADN se clonaron en el vector pAbAi Y1H (Clontech, Mountain View, EE. UU.) utilizando sitios de restricción adecuados. Luego, cada construcción pAbAi ensamblada se linealizó con BstbI y se transformó en la cepa Y1HGold de Saccharomyces cerevisiae de acuerdo con el Manual del Sistema de Transformación de Levaduras 2 (Clontech, Mountain View, EE. UU.). Los clones que portaban el fragmento de ADN deseado se examinaron para detectar la autoactivación en un medio sintético sin uracilo suplementado con Aureobasidin A en una concentración de 100–900 ng/mL, como se indica (Clontech, Mountain View, EE. UU.)[2].
Los marcos de lectura abiertos (ORF) de los genes SlBES1 se amplificaron y se ligaron en el plásmido pGBKT7-GAL4BD. Las construcciones de fusión GAL4BD-SlBES1 se transformaron posteriormente en células de levadura Y2H Gold.−Se utilizaron placas de medio Trp para cultivar los transformantes de levadura.El alfaLa actividad de -galactosidasa de los transformantes se identificó mediante X-alfa-gal y la expresión de AUR1-C se examinó mediante Aureobasidin A[3].
3. Concentraciones inhibitorias mínimas de Aureobasidin para varias levaduras
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| Cepa | CMI (µg/mL) |
| S. cerevisiae | ATCC9763 (diploide) | 0,2-0,4 |
| SH3328 (haploide) | 0,1 | |
| Levadura de sake (diploide) | 0,1-0,2 | |
| Levadura de shochu (diploide) | 0,1 | |
| Levadura de cerveza (triploide o tetraploide) | 0,1 | |
| Panadero'levadura s (diploide) | 0,2-0,4 | |
| Pombe esquizofrénico | JY-745 (monoploide) | 0,1 |
| C. albicans | TIMM-0136（diploide） | 0,04 |
| C.tropicales | TIMM-0324（diploide） | 0,08 |
4. Procedimientos operativos (para sistemas de transformación de levaduras resistentes a AbA)
1) Agregue 0,5 mL de cultivo de levadura durante la noche a 50 mL de medio YPD (composición: 1 L de medio líquido contiene 10 g de extracto de levadura, 20 g de polipeptona, 20 g de D-glucosa; para medio sólido, agregue un 2 % adicional de agar).
2) Incubar a 30℃ Durante aproximadamente 6 horas, hasta que la DO660 sea de 1 a 2. Cuando se utilicen diploides, la DO660 debe ser de 2 a 4.
3) Centrifugar a 1.000×g durante 5 minutos.
4) Resuspender el pellet en 10 mL de Solución A (composición: 100 mM de acetato de litio, 10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 1 mM de EDTA) y centrifugar a 1.000 °C.×g durante 5 minutos.
5) miSuspenda el pellet en la Solución A hasta que la OD660 sea 150.
6) Alícuota 100 µL de la suspensión celular en un tubo e incuba a 30℃ por 1 hora.
7) Agregue 5 µg del vector (ADN circular o lineal) y 150 µg de ADN portador (que se ha calentado a 100℃ durante 10 minutos y luego se enfrió rápidamente).
Nota: pAUR101 requiere ADN lineal para su transformación. El uso de ADN circular reducirá la eficiencia de la transformación o incluso puede fallar. pAUR112 y pAUR123 requieren ADN plasmídico completo para su transformación.
8) Añadir 850 µL de Solución B (composición: disolver 40 g de Polietilenglicol 4000 en 100 mL de Solución A y mezclar bien, preparar fresco antes de usar) y mezclar suavemente.
9) Incubar a 30℃ durante 30 minutos, luego a los 42℃ durante 15 minutos.
10) Dejar reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
11) Centrifugar a 5000 rpm durante 1 minuto y resuspender el pellet en 5 ml de medio YPD.
12) Incubar a 30℃ Durante 6 horas o durante la noche.
13) Centrifugar a 5.000-10.000 rpm y resuspender el pellet en 1-10 mL de NaCl al 0,9%.
14) Coloque 100 µL de la suspensión celular en placas de medio selectivo YPD (que contienen una cierta concentración de AbA, dependiendo del tipo de cepa).Incubar a 30℃ durante 3-4 días hasta que la transformación esté completa.
15) Seleccione transformantes positivos y/o determine la eficiencia de la transformación (expresada como el número de colonias transformadas por microgramo de ADN plasmídico).
Documentos:
Hoja de datos de seguridad
Manuales
Cifras
Figura 1. Tabla de crecimiento de placa de levadura
Cepa experimental:GS115
Cantidad de uso: 0,05 μg/ml、0,1 μg/ml、0,5 μg/ml、1 μg/ml
Tratamiento: 3-5 Díaestá a las 30℃
La fila superior es el producto yeasen, y la fila inferior es la marca T*.
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