آیا می خواهید رشد تومور را در موش های برهنه در زمان واقعی کنترل کنید؟ آیا می خواهید محل کلونیزاسیون سلولی در موش ها را بدانید؟ آیا می خواهید تاثیر درمان دارویی بر تومورها را بدانید in vivo? اینها را می توان با نصب یک ردیاب بر روی سلول به دست آورد که به شما امکان می دهد مکان و تعداد سلول ها را در هر زمان کنترل کنید. این فناوری، فناوری "تشخیص" تصویربرداری in vivo است. بنابراین فناوری تصویربرداری in vivo چیست؟

1. فناوری تصویربرداری in vivo چیست؟
2. ویژگی های تصویربرداری لوسیفراز
3. جهت کاربرد تصویربرداری لوسیفراز
4. به اشتراک گذاری نمونه های تجربی
5. سوالات متداول
6. اطلاعات محصول
7. در مورد خواندن

1. فناوری تصویربرداری in vivo چیست؟

در اوایل سال 1999، دکتر Weissleder از دانشگاه هاروارد در ایالات متحده مفهوم تصویربرداری مولکولی را پیشنهاد کرد، یعنی استفاده از روش های تصویربرداری برای انجام تحقیقات کمی و کیفی در مورد فرآیندهای بیولوژیکی در داخل بدن در سطوح سلولی و مولکولی. تصویربرداری in vivo بر اساس تصویربرداری مولکولی است. از طریق این سیستم تصویربرداری، فرآیندهای بیولوژیکی مانند رشد و متاستاز تومور، ایجاد بیماری های عفونی و بیان ژن های خاص را می توان در حیوانات زنده مشاهده کرد.

در داخل بدن، تصویربرداری نوری از حیوانات زنده عمدتاً از دو فناوری استفاده می کند: بیولومینسانس و فلورسانس. بیولومینسانس ژن لوسیفراز برای علامت گذاری سلول ها یا DNA است، در حالی که فناوری فلورسانس از ژن های گزارشگر فلورسنت مانند پروتئین فلورسنت سبز و پروتئین فلورسنت قرمز و فلورسانس مانند FITC، Cy5 و Cy7 استفاده می کند. عناصر و نقاط کوانتومی (QD) برای برچسب گذاری. بیولومینسانس پستانداران به طور کلی ژن لوسیفراز کرم شب تاب (متشکل از 554 نوکلئوتید، حدود 50 کیلو دالتون)، یعنی ژن لوسیفراز را در DNA کروموزومی سلول مشاهده مورد انتظار برای بیان لوسیفراز ادغام می کند. سپس یک رده سلولی را پرورش دهید که بتواند به طور پایدار لوسیفراز را بیان کند و هنگامی که سلول ها تقسیم، تمایز و انتقال می شوند، لوسیفراز نیز به بیان پایدار ادامه می دهد. ژن‌ها، سلول‌ها و حیوانات زنده همگی می‌توانند با ژن لوسیفراز برچسب‌گذاری شوند. لوسیفراز نوعی آنزیم است که می تواند سوبستراها را برای تولید بیولومینسانس کاتالیز کند. لوسیفرازها از منابع مختلف ویژگی های خود را دارند و می توانند بسترها را برای ساطع رنگ های مختلف نور کاتالیز کنند. در میان آنها، کرم شب تاب لوسیفراز دارای حساسیت بالا و دامنه خطی گسترده ای از 7 تا 8 مرتبه قدر است. این ژن به متداول ترین ژن گزارشگر سلولی پستانداران تبدیل شده است. پلاسمید گزارشگر لوسیفراز به داخل سلول ها منتقل شد و سوبسترای آن لوسیفرین برای انکوباسیون سلول ها اضافه شد. در حضور ATP، O₂و یون های منیزیم، لوسیفراز می تواند سوبسترای لوسیفرین را اکسید کند تا واکنش نور مرئی ایجاد کند. "نصب یکباره "ردیاب" را درک کنید و هر زمان که بخواهید ردیابی و شناسایی کنید. علاوه بر کرم شب تاب، گاهی اوقات از رنیل لوسیفراز نیز استفاده می شود. بسترهای این دو متفاوت است، بستر اولی D-luciferin و سوبسترای دومی coelenterazine است. طول موج ساطع نور این دو متفاوت است، محدوده طول موج نوری که توسط اولی ساطع می شود 540-600 نانومتر است و محدوده طول موج نور منتشر شده توسط دومی 460-540 نانومتر است. نور ساطع شده توسط اولی راحت تر از بافت ها عبور می کند، در حالی که دومی سریعتر در بدن متابولیزه می شود و ویژگی آن به خوبی اولی نیست. بنابراین، اکثر آزمایش‌های in vivo از لوسیفراز کرم شب‌تاب به عنوان یک ژن گزارشگر استفاده نمی‌کنند.

شکل 1.محلی سازی سلول های نشاندار شده با لوسیفراز

اصل نوری بیولومینسانس: نور هنگام انتشار در بافت پستانداران پراکنده و جذب می شود و فوتون ها هنگام برخورد با غشای سلولی و سیتوپلاسم شکسته می شوند و انواع مختلف سلول ها و بافت ها ویژگی های متفاوتی برای جذب فوتون دارند. هموگلوبین عامل اصلی جذب نور مرئی در بدن است و می تواند بیشتر نوار آبی-سبز نور مرئی را جذب کند. اما در باند نور قرمز نور مرئی بیشتر از 600 نانومتر، جذب هموگلوبین بسیار کم است. بنابراین، مقدار زیادی نور می تواند از بافت و پوست عبور کند تا در ناحیه مایل به قرمز تشخیص داده شود. حداقل چند صد سلول زیر جلدی را می توان با استفاده از فناوری تصویربرداری بیولومینسانس جانوران زنده شناسایی کرد. با این حال، بسته به عمق منبع نور در ماوس، حداقل تعداد سلول هایی که می توان دید متفاوت است. به طور کلی، به ازای هر افزایش 1 سانتی‌متری، شدت نور 10 برابر کاهش می‌یابد و این تضعیف برای بافت‌ها و اندام‌های غنی از خون بیشتر و برای بافت‌ها و اندام‌های مجاور استخوان‌ها ضعیف‌تر است. در مورد عمق یکسان، شدت نور شناسایی شده رابطه خطی قابل توجهی با تعداد سلول ها دارد و شدت نور شناسایی شده را می توان توسط ابزار اندازه گیری کرد تا تعداد سلول ها را منعکس کند.

شکل 2. اصل درخشندگی واکنش نمک پتاسیم لوسیفراز و لوسیفرین

متفاوت از بیولومینسانس، فناوری فلورسانس از ژن‌های گزارشگر فلورسنت یا رنگ‌های فلورسنت (از جمله مواد جدید برچسب‌گذاری نانو مانند نقاط کوانتومی فلورسنت) برای برچسب‌گذاری استفاده می‌کند. با استفاده از فلورسانس از ژن های گزارشگر، پروتئین های فلورسنت یا رنگ ها، می توان یک منبع نور بیولوژیکی در داخل بدن ایجاد کرد. بیولومینسانس در حیوانات بدون منبع نور تحریک کننده اتوفلورسانس است، در حالی که فلورسانس قبل از اینکه توسط سیستم تصویربرداری شناسایی شود نیاز به تحریک توسط یک منبع نور تحریک خارجی دارد. برچسب های فلورسنت به طور گسترده ای مورد استفاده قرار می گیرند، از جمله حیوانات، سلول ها، میکروارگانیسم ها، آنتی بادی ها، داروها، نانومواد و غیره.

2. ویژگی های تصویربرداری لوسیفراز

◎ بدون تشعشع، تقریباً برای موجودات بی ضرر است.

◎ بیولومینسانس بدون منبع نور تحریک.

◎ حساسیت بالا، صدها سلول را می توان شناسایی کرد.

◎ نفوذپذیری خوب، عمق بافت 3-4 سانتی متری هنوز قابل تشخیص است.

◎ نسبت سیگنال به نویز بالا، سیگنال فلورسانس قوی و ضد تداخل خوب.

3. جهت کاربرد تصویربرداری لوسیفراز

3.1 رشد تومور

در آزمایش تومورزایی در موش‌های برهنه، رشد تومور در زمان واقعی بدون تهاجم مشاهده شد و نیازی به جدا کردن تومور برای اندازه‌گیری نبود.

3.2 داروهای انکولوژی

تأثیر تجویز بر رشد یا متاستاز تومور شناسایی شد و بستر فلورسین را می‌توان در عرض 3 ساعت بدون تداخل با آزمایش دارو حذف کرد.

3.3 محلی سازی سلول

محلی سازی و توزیع سلول های خارجی در حیوانات تشخیص داده شد.

3.4 تنظیم بیان ژن

ژن هدف یا پروموتر ژن هدف با ژن لوسیفراز ادغام شد تا تغییرات بیان ژن در طول درمان دارویی یا دوره بیماری را تشخیص دهد.

3.5 تحقیقات سلول های بنیادی

نظارت بر پیوند، بقا و تکثیر سلول های بنیادی؛ ردیابی توزیع و مهاجرت سلول های بنیادی in vivo.

4. آزمایش کنید مثال اشتراک گذاری

شکل 3. in vivo تشخیص تصویربرداری اثر درمانی CAR-MUC1 T/CAR-MUC1-IL22 سلول های T بر تشکیل تومور با تزریق زیر جلدی سلول های HN4 در موش ها^[1].

شکل 4. پس از تزریق سلول های HUC-MSCs به عضله اسکلتی موش، محلی سازی سلول ها توسط in vivo تصویربرداری (با فلش قرمز مشخص شده است)^[2].

شکل 5. توانایی از in vivo تصویربرداری برای تشخیص مهاجرت سلول های بنیادی مزانشیمی (MSC) به محل سوختگی. سلول های بنیادی مزانشیمی (MSC/FLuc) به صورت داخل وریدی به مدل سوختگی پشت موش تزریق شد. چهار روز پس از تزریق، سیگنال های بیولومینسانس در محل آسیب دیده زخم سوختگی ظاهر شد و سپس به تدریج کاهش یافت (فلش قرمز محل سوختگی را نشان می دهد).^[3].

5. سوالات متداول

Q1: در مقایسه با فناوری سنتی، مزایای فناوری تصویربرداری بیولومینسانس چیست؟

در مقایسه با فناوری سنتی، این فناوری در تحقیق متاستاز تومور، ژن درمانی، اپیدمیولوژی، ردیابی سلول های بنیادی، سرطان خون و سایر تحقیقات مرتبط از روش های سنتی حساس تر است. همچنین می تواند به سرعت و به طور شهودی پاتوژنز و غربالگری دارویی بیماری های مرتبط را از طریق یک سری مدل های بیماری تراریخته حیوانی مطالعه کند.

Q2: چگونه سلول های بنیادی را با ژن لوسیفراز برچسب گذاری کنیم؟

ژن‌های بیان شده را می‌توان برای ساخت موش‌های تراریخته نشان‌گذاری کرد و سلول‌های بنیادی را نشان‌گذاری کرد. سلول های بنیادی خونساز از مغز استخوان موش گرفته شده و به مغز استخوان موش دیگر پیوند زده می شود. از این فناوری می توان برای ردیابی تکثیر، تمایز و مهاجرت سلول های بنیادی خونساز در بدن استفاده کرد. روش دیگر برچسب گذاری سلول های بنیادی با لنتی ویروس است.

Q3: چه مدت پس از تزریق فلورسین آزمایش مناسب است و چه مدت می تواند لومینسانس طول بکشد؟

به طور کلی، سیگنال فلورسانس پس از تزریق داخل صفاقی برای 10-15 دقیقه به قوی ترین دوره پایدار می رسد و پس از 20-30 دقیقه شروع به پوسیدگی می کند. پس از 3 ساعت، فلورسئین حذف می شود و لومینسانس به طور کامل ناپدید می شود.

Q4: چگونه فلورسئین را به موش تزریق کنیم؟ تفاوت روش های تزریق چیست؟

فلورسئین را می توان با تزریق داخل صفاقی یا تزریق ورید دم به موش ها تزریق کرد. می تواند در حدود 1 دقیقه به کل بدن موش سرایت کند. در اغلب موارد غلظت فلورسئین 150 میلی گرم بر کیلوگرم است. برای موش های 20 گرمی می توان از حدود 3 میلی گرم فلورسین استفاده کرد. برای تزریق داخل صفاقی، انتشار آهسته، لومینسانس اولیه آهسته و زمان لومینسانس مداوم طولانی است. برای تزریق فلورسین به ورید دم، به سرعت منتشر می شود و به سرعت شروع به انتشار نور می کند، اما مدت لومینسانس کوتاه است.

6.اطلاعات محصول

Yeasen یک شرکت بیوتکنولوژی است که در تحقیق، توسعه، تولید و فروش سه معرف اصلی بیولوژیکی فعالیت می کند: مولکول ها، پروتئین ها و سلول ها. محصولات ارائه شده توسط Yeasen به شرح زیر می باشد.

جدول 1. اطلاعات محصول

7. در مورد خواندن

نسل جدیدی از سیستم تشخیص ژن گزارشگر لوسیفراز - آسان‌تر، حساس‌تر، دقیق‌تر