دیابت شیرین (DM)، یک بیماری متابولیک مزمن سیستمیک که با افزایش مزمن گلوکز خون ناشی از ترکیبی از عوامل متعدد بیماری مشخص می شود، یک بیماری همه گیر بهداشتی جهانی است و به ژنتیک خانوادگی، عوامل محیطی مرتبط است. و خودایمنی حتی اگر DM برای هزاران سال شناخته شده است و پیشرفت های زیادی در تشخیص و مدیریت آن حاصل شده است، در حال حاضر هیچ درمانی برای این بیماری وجود ندارد و پیامدهای سلامت عمومی آن تنها در حال افزایش است. بنابراین، ایجاد یک مدل حیوانی مناسب برای DM و روشن کردن پاتوژنز DM و عوارض آن بسیار مهم است. مدل‌های حیوانی متداول DM عبارتند از برداشتن جراحی پانکراس، دیابت ناشی از مواد شیمیایی، مدل حیوانی دیابت خودبخودی و حیوانات تراریخته و غیره.

در حال حاضر، مدل بیماری دیابت ناشی از استرپتوزوتوسین (STZ) به طور گسترده استفاده می شود، مناسب برای مشاهده طولانی مدت. STZ یک ترکیب نیتروزوره است که وقتی وارد بدن می شود، می تواند به طور خاص سلول های β پانکراس را از طریق مکانیسم های زیر از بین ببرد:

(1) تزریق STZ با دوز بالا ممکن است باعث کاهش غلظت کوآنزیم داخل سلولی I (NAD) در سلول‌های β شود و در نتیجه انرژی وابسته به NAD و متابولیسم پروتئین را مهار کند و منجر به مرگ سلولی شود.

(2) STZ اکسید نیتریک (NO) را افزایش می دهد تولید، که نشان داده شده است در آسیب سلول های β شرکت می کند.

(3) در دوز پایین، STZ می‌تواند یک فرآیند خودایمنی را ایجاد کند که منجر به تخریب سلول‌های β جزایر پانکراس می‌شود: سلول‌های بتا مرده، به دلیل دوز پایین STZ، می‌توانند توسط ماکروفاژها به عنوان آنتی‌ژن فاگوسیته شوند تا فاگوسیته Th1 تولید کنند و لنفوسیت‌های نوع Th1 را غالب کنند. سپس لنفوسیت های نوع Th1 IL-2 و IFN-γ تولید می کنند و باعث نفوذ سلول های التهابی در جزیره و آزاد شدن IL-1 و TNF-α، IFN-γ، NO و H می شوند.₂O₂ برای کشتن سلول ها و در نهایت القای DM.

Yeasen Biotech میزان موفقیت بالایی را فراهم می کند STZ (Cat#60256ES) برای مدل سازی: خلوص بالا ≥ 98٪ (HPLC).

1 SOP استاندارد برای ساخت مدل دیابت ناشی از STZ

1.1 آماده سازی حیوانات

دیمورفیسم جنسی مشخص است و مردان بیشتر مستعد ابتلا به دیابت هستند. از آنجایی که استروژن با عملکرد STZ تداخل می کند، حیوانات ماده نسبت به نر نسبت به عملکرد دیابت زایی STZ حساسیت کمتری دارند. مطالعات نشان داده است که زنان نرخ مدل‌سازی ضعیف و میزان مرگ و میر بالاتری نسبت به مردان دارند، به خصوص نوع I.

دیابت نوع I (T1DM): موش (170-200 g) و موش (17-22 ز) توصیه می شود. پس از یک هفته تغذیه تطبیقی، حیوانات ناشتا به مدت 12 ساعت و سپس تزریق داخل صفاقی STZ که به راحتی و با درصد موفقیت بالا قابل عمل است.

دیابت نوع دوم (T2DM): موش ها (سن 5-4 هفته، وزن 90-100 گرم، به عنوان مثال SD یا Wistar) و موش ها (سن 4-5 هفته، وزن 16-20 گرم، به عنوان مثال C57، ICR یا Kunming) باید به مدت 4-6 هفته قبل از تجویز STZ با رژیم غذایی پرچرب و قند بالا تغذیه شوند. 30-35 گرم SD برای موش و C57 برای موش توصیه می شود.

1.2 تغذیه حیوانات قبل از تجویز STZ

T1DM: به همه موش‌ها و موش‌ها اجازه دسترسی آزاد به رژیم غذایی و آب استاندارد غذای جوندگان 1 تا 2 هفته قبل از درمان با STZ بدهید.

T2DM: مصرف یک رژیم غذایی پرچرب و قند بالا برای ایجاد مقاومت به انسولین قبل از درمان STZ.

1.3 آماده سازی معرف

① رژیم غذایی پرچرب و قند بالا

رژیم غذایی پرچرب و پر قند با مخلوط کردن غذای پایه موش با ساکارز، چربی گوشت خوک تصفیه شده و پودر زرده تخم مرغ در یک نسبت جرمی ساخته می شود: این نسبت ها 10٪ چربی گوشت خوک، 20٪ ساکارز، 10٪ پودر زرده تخم مرغ، 0.5٪ کلات سدیم و 59.5٪ خوراک پایه است.

② بافر STZ-سدیم سیترات

تهیه محلول A و محلول B: 2.1 گرم اسید سیتریک (MW: 210.14) وزن کرده و آن را در 100 میلی لیتر آب دوبار مقطر حل کنید تا محلول A بسازید. 2.94 گرم سیترات سدیم (MW: 294.10) را وزن کرده و در 100 میلی لیتر آب دوبار مقطر حل کنید تا محلول B بسازید.

تهیه بافر سیترات سدیم: محلول های A و B را با نسبت معینی (1:1.32 یا 1:1) مخلوط کنید، pH را روی 4.2-4.5 تنظیم کنید و با استفاده از یک غشای فیلتر 0.22 میکرومتر استریل کنید. این بافر مورد نیاز سیترات سدیم را ایجاد می کند. توصیه می شود بلافاصله آن را تهیه و استفاده کنید.

پودر لیوفیلیزه STZ را وزن کرده، آن را در یک بطری خشک و استریل قرار دهید، با فویل آلومینیومی بپیچید و روی یخ قرار دهید. بافر سیترات سدیم از قبل خنک شده (1% w/v) را برای حل شدن اضافه کنید و با استفاده از یک غشای فیلتر 0.22 میکرومتر استریل کنید.

【نکته】① پس از بیرون آوردن پودر STZ از یخچال، باید حدود 10 دقیقه در دمای اتاق و دور از نور نگهداری شود تا کاملاً ذوب شود. ② پس از توزین، بطری حاوی نمونه STZ باید با فویل آلومینیومی پوشانده شود تا از نور محافظت شود، زیرا STZ ناپایدار است. ③ اگر در تزریق مهارت ندارید، STZ را در یک زمان حل نکنید. توصیه می شود STZ را به صورت گروهی با توجه به مهارت عملیات حل کنید. محلول STZ را برای یک گروه در یک زمان مانند 10 یا 15 موش / موش در هر گروه آماده کنید.

1.4 تزریق STZ

تزریق را به صورت داخل صفاقی یا از طریق ورید دم بر اساس وزن حیوان ناشتا انجام دهید. در مقایسه با تزریق داخل صفاقی، تزریق ورید دم کارایی مصرف دارو بالاتری دارد اما از نظر فنی چالش برانگیزتر است. در صورت عدم تسلط بر روش تزریق، تزریق را به طور متناوب بین دو گروه انجام دهید و تزریق باید در عرض 30 دقیقه انجام شود.

T1DM: برای موش‌ها، دوز بالای 100-200 میلی‌گرم بر کیلوگرم و دوزهای کم چندگانه با دوز 50-20 میلی‌گرم بر کیلوگرم برای پنج روز متوالی توصیه می‌شود. برای موش‌ها، دوز 40-70 میلی‌گرم بر کیلوگرم پیشنهاد می‌شود که در یک تزریق تجویز می‌شود.

T2DM:پس از تغذیه با رژیم غذایی پر قند و چربی به مدت 1-2 ماه، برای موش، دوز 70-120 میلی گرم بر کیلوگرم توصیه می شود که در یک تزریق تجویز می شود. برای موش‌ها، دوز پیشنهادی 25-40 میلی‌گرم بر کیلوگرم است که در یک تزریق تجویز می‌شود.

【نکته】 انجام آزمایش اولیه برای تعیین دوز مناسب STZ با توجه به وزن متفاوت، تحمل دارو، زمان ناشتا، روش تزریق و فرآیند تغذیه حیوانات آزمایشگاهی توصیه می شود. کورکورانه آزمایش را به طور مستقیم طبق دوز موجود در ادبیات انجام ندهید.

1.5 بعد از تزریق

پس از تزریق STZ، اجازه دهید حیوانات آزادانه آب و غذا بخورند. بالشتک را هر روز عوض کنید. قفس را تمیز و خشک نگه دارید. از نور شدید خورشید اجتناب کنید. تا حد امکان ضدعفونی کنید.

【نکته】پس از تزریق STZ، سطح گلوکز خون حیوانات سه مرحله را نشان می دهد: هیپرگلیسمی گذرا (1-2 ساعت)، هیپوگلیسمی گذرا (6-10 ساعت) و هیپرگلیسمی مداوم (بیش از 72 ساعت). انسولین و گلوکز باید به درستی تامین شود.

1.6 راه حل مدل سازی حیوانات

برای مدل‌هایی که معیارها را برآورده نمی‌کنند، می‌توان STZ را به‌محض تثبیت حیوان (با تزریق داخل صفاقی با دوز 10-20 میلی‌گرم بر کیلوگرم، انتخاب دوز مناسب بر اساس وضعیت واقعی)، یا صبر کرد تا سطح گلوکز خون به حالت عادی برگردد و سپس با دوز معمول تزریق شود. با این حال، برای دستیابی به اثر مورد نظر، اغلب لازم است که فرآیند مدل سازی پس از بازگشت به حالت عادی مجدداً راه اندازی شود.

2 ارزیابی از STZ ناشی از DM مدل های حیوانی

① مشخصات کلی: کاهش وزن بدن، پلی دیپسی، پلی فاژی و پلی اوری.

② قند خون ناشتا (FGB)، سطح انسولین سرم (FINS)، تحمل گلوکز خوراکی (OGT)، انسولین سرم ناشتا (FSI) و حساسیت به انسولین.

③ شاخص های بیوشیمیایی سرم: T-Cho، TG، HDL-C، LDL-C، CR، BUN، Alt و غیره.

④ آسیب شناسی پانکراس: رنگ آمیزی H&E.

3 دلایل احتمالی شکست مدل DM القایی STZ

① کیفیت پایین STZ. خلوص STZ برای مدل سازی نباید کمتر از 98٪ باشد (تشخیص HPLC).

② تخریب STZ محلول STZ آسان به مرطوب است، باید خشک نگه داشته شود، برای جلوگیری از رطوبت. پودر از قرار دادن طولانی مدت در دمای اتاق جلوگیری می کند، و STZ حل شده بسیار ناپایدار است، با نیمه عمر pH خنثی 15 دقیقه، و باید در جای خود استفاده شود. لطفا STZ را با مقدار pH اسیدی ترجیحاً در حمام یخ حل کنید.

③ محلول STZ به روده یا سایر اندام ها تزریق شد.

اگر مدل استاندارد DM را نداشت، توصیه می شود تا 3 روز دیگر رعایت شود. اگر باز هم شکست خورد، روش تزریق را تکرار کنید.

4 علل مرگ و میر بالای حیوانات ناشی از STZ

① حیوانات کم وزن هستند.

② تامین ناکافی آب آشامیدنی.

③ هیپرگلیسمی یا هیپوگلیسمی، معمولا هیپرگلیسمی. این می تواند با تزریق انسولین یا مکمل گلوکز موقت کاهش یابد.

روش مکمل انسولین: به عنوان مثال اگر نوولین N یا NPH (انسولین روی پروتامین خنثی) هر بار 2-3 واحد داده شود، مرگ و میر عمومی موش ها بعد از 3-5 روز کمتر می شود.

روش مکمل گلوکز: تزریق داخل صفاقی گلوکز 20 درصد 4 ساعت پس از تزریق STZ می تواند از مرگ موش ها به دلیل کاهش قند خون ناشی از ناشتا جلوگیری کند.

④ حیوانات آزمایشی به دلیل کمبود غذا و آب یکدیگر را می کشند.

⑤ عفونت. حیوانات DM به دلیل پلی اوری بیشتر مستعد ابتلا به عفونت هستند، به ویژه عفونت مجاری ادراری و عفونت شکمی. ضدعفونی قبل و بعد از اعمال تهاجمی مانند تزریق داخل صفاقی، تزریق زیر جلدی و خونگیری ضروری است. به عنوان مثال، تتراسایکلین (یا پماد چشمی اورئومایسین) را می توان پس از اندازه گیری قند خون هر بار برای جلوگیری از عفونت، روی زخم استفاده کرد.

5 عامل موثر بر مدل سازی دیابت

عوامل موثر بر مدل بیماری دیابت شامل کیفیت معرف مدل سازی STZ، وضعیت حیوانات و روش تجویز است. ویژگی های اصلی عملکرد معرف شامل خلوص، پایداری و حلالیت است. وضعیت حیوانات عمدتاً شامل زمینه ژنتیکی، جنس، جنسیت، وزن، محیط پرورش و ساختار رژیم غذایی است. روش های تجویز شامل زمان مصرف، فواصل بین دوزها و راه های مصرف است. عوامل متمایز اثرات مدلسازی متمایز ایجاد می کنند.

6 محصول rتوصیه

نام محصول	گربه#	مشخصات
استرپتوزوسین (STZ)	60256ES60	100 میلی گرم
	60256ES76	500 میلی گرم
	60256ES80	1 گرم
اسید سیتریک، مونوهیدرات	60347ES25	25 گرم
نمک تری سدیم اسید سیتریک، دی هیدرات	60348ES25	25 گرم
حلال برای استرپتوزوسین STZ	60750ES76	500 میلی لیتر

[1] Xi Z و همکاران. نانوذرات اصلاح شده دوگانه بر موانع جذب متوالی برای تحویل انسولین خوراکی غلبه می کنند. J کنترل انتشار. فوریه 2022؛ 342: 1-13. (PMID: 34864116, IF: 7.727)