دوستان عزیز، آیا هنگام مواجهه با آنتی بادی های کنترل بارگذاری و برچسب گذاری اپی توپ مختلف در حین بلات پروتئینی احساس ضرر می کنید؟ کنترل بارگذاری پروتئین ها توسط ژن های خانه دار در موجودات رمزگذاری می شوند و به طور پایدار در بافت های متعدد بیان می شوند. آنها برای بررسی اینکه آیا آزمایش های ایمونولوژیک به طور عادی و به عنوان یک استاندارد تشخیص نیمه کمی برای بیان پروتئین پیش می روند یا خیر استفاده می شوند. بنابراین، چگونه آنتی بادی های کنترل بارگذاری را به درستی انتخاب می کنید؟ می توانید به نکات زیر مراجعه کنید.

I. منشاء گونه های نمونه

برای نمونه‌هایی از بافت‌ها یا سلول‌های پستانداران، معمولاً β-اکتین، α-توبولین، GAPDH، Lamin-B، هیستون H3، Na+/K+-ATPase را انتخاب کنید.
برای نمونه های مشتق شده از گیاه، به طور کلی اکتین گیاهی، روبیسکو و غیره را انتخاب کنید.
برای نمونه های دیگر با تحقیقات کمتر، پروتئین مناسب را به عنوان مرجع داخلی با مراجعه به ادبیات یا پایگاه های داده مربوطه انتخاب کنید.

II. وزن مولکولی پروتئین هدف

اطمینان حاصل کنید که وزن مولکولی پروتئین هدف با وزن کنترل بارگذاری متفاوت است بیش از 5 کیلو دالتون برای جلوگیری از تداخل در حین تشخیص. به عنوان مثال، اگر پروتئین هدف 40 کیلو دالتون باشد، انتخاب β-اکتین (42 کیلو دالتون) به عنوان کنترل بارگذاری مناسب نیست. استفاده از GAPDH (36KDa) یا β-توبولین (55KDa) را به عنوان کنترل بارگذاری در نظر بگیرید.

III. سایت بیان پروتئین مرجع داخلی

بنابراین، انتخاب کنترل بارگذاری پروتئین با محل استخراج پروتئین متفاوت است. برای مثال، هنگام استخراج پروتئین‌های سیتوپلاسمی و هسته‌ای به‌جای پروتئین کل، کنترل بارگذاری را انتخاب کنید. پروتئین های بیان شده در سایت مربوطه. به عنوان مثال، H3 به شدت و پایدار در هسته سلول بیان می شود و از نظر تئوری در سیتوپلاسم بیان نمی شود. بنابراین، برای استخراج پروتئین سیتوپلاسمی، H3 نباید به عنوان یک پروتئین مرجع داخلی استفاده شود. در عوض، β-اکتین، GAPDH، α-توبولین و غیره را انتخاب کنید که در سیتوپلاسم به عنوان پروتئین مرجع داخلی بیان می شوند.

توجه: هنگام استفاده از شرایط زیر اجتناب کنید آنتی بادی های کنترل بارگذاری

محلی سازی درون سلولی	بارگیری پروتئین کنترل	وزن مولکولی (KDa)	یادداشت ها
سیتوپلاسم، سلول کامل	بتا اکتین	42	برای عصاره های هسته ای مناسب نیست. β-اکتین جزء کمپلکس های بازسازی کروماتین است. ممکن است برای موقعیت هایی که در آن تفاوت های سنی قابل توجهی بین افراد مورد تحقیق وجود دارد مناسب نباشد.
	α-توبولین	55	برای شرایطی که تفاوت سنی قابل توجهی بین افراد مورد تحقیق وجود دارد مناسب نیست. بیان توبولین با داروهای ضد میکروبی و ضد قارچی تغییر می کند، بنابراین هنگام افزودن داروهای ضد سرطان و ضد قارچ مناسب نیست.
	β-توبولین	55
	GAPDH	36	هیپوکسی سلولی باعث افزایش بیان GAPDH می شود، بنابراین برای مطالعات مربوط به اکسیژن مناسب نیست. عواملی مانند دیابت می تواند منجر به افزایش بیان GAPDH شود.
	وینکولین	117	می توان به پروتئین های با وزن مولکولی بزرگ اشاره کرد.
میتوکندری	سری COXIV	15-17	این سری از پروتئین ها عمدتاً در 15-17 کیلو دالتون متمرکز شده اند. اگر وزن مولکولی پروتئین هدف نزدیک است، سایر آنتی بادی های کنترل بارگذاری را در نظر بگیرید.
میتوکندری	HSP60	60
هسته	VDAC1/2	31-37	این سری از پروتئین ها عمدتاً در 31-37 کیلو دالتون متمرکز شده اند.
	لامین B1	66	برای سلول های بنیادی جنینی مناسب نیست، به عنوان کنترل بارگذاری مناسب نیست در آزمایشات آپوپتوز
	PCNA	36	برای سلول های غیر تکثیر مناسب نیست.
	TBP	33-43	TBP 37-43 KDa در انسان و 33-36 KDa در موش و موش است، برای آزمایش آپوپتوز مناسب نیست.
	YY1	65-70
	هیستون H3	17	اکثر پروتئین ها دارای وزن مولکولی حدود 17 کیلو دالتون هستند. اگر وزن مولکولی پروتئین هدف نزدیک است، سایر آنتی بادی های کنترل بارگذاری را در نظر بگیرید.
خون کامل، سرم، پلاسما	ترانسفرین	77	بیان تحت تأثیر حالات و درمان های خاص بیماری مانند رتینوئیک اسید قرار می گیرد.
خون کامل، سرم، پلاسما	آلبومین	66	محتوا بسیار بالا است، به کاهش بارگذاری نمونه در آزمایشات WB توجه کنید.

برچسب آنتی بادی ها وقتی با هم استفاده می شوند بهتر عمل می کنند

در آزمایش‌هایی که برهمکنش‌های پروتئینی را مطالعه می‌کنند، مانند pull-down، برچسب‌های اپی‌توپ را می‌توان از طریق روش‌های بیولوژیکی مولکولی به انتهای N یا C پروتئین هدف ترکیب کرد. تگ های اپی توپ رایج شامل His، HA، Myc و GST هستند. این تگ های اپی توپ معمولاً بر فعالیت بیولوژیکی و محلی سازی درون سلولی پروتئین هدف تأثیر نمی گذارد. ظهور برچسب های اپی توپ، راحتی را برای تحقیقات علمی و تولید صنعتی فراهم کرده است.

برچسب اپی توپ	دنباله برچسب	وزن مولکولی (KDa)
تگ HA	YPYDVPDYA	1.1
Myc Tag	EQKLISEEDL	1.2
برچسب پرچم	DYKDDDDK	1
برچسب GST	-	26
برچسب GFP	-	26.9
برچسب V5	GKPIPNPLLGLDST	1.4
گوزن نر	KETAAAKFERQHMDS	1.8
تگ الکترونیکی	GAPVPYPDPLEPR	1.4

اطلاعات محصول

تایپ کنید	نام محصول	وزن مولکولی (KDa)	شماره محصول
در حال بارگذاری آنتی بادی کنترل	β-اکتین، بادی موش	42	30101ES
	β-اکتین، خرگوش pAb	42	30102ES
	GAPDH (Clone:1A6)، ماوس mAb	36	30201ES
	GAPDH، خرگوش pAb	36	30202ES
	α-توبولین، mAb موش	50-55	30304ES
	β-توبولین، mAb موش	50-55	30301ES
	β-توبولین، خرگوش pAb	50-55	30302ES

مقاله قبلی مقاله بعدی