1 اصل عمل ژنتیکومایسین

ژنتومایسین (Geneticin، G418) یک آنتی بیوتیک آمینوگلیکوزید است که با مسدود کردن گسترش زنجیره پپتیدی با اتصال به ریبوزوم های 70S و 80S در سلول های پروکاریوتی و یوکاریوتی، سنتز پروتئین را مهار می کند. این مکانیسم برای باکتری ها، مخمرها، گیاهان و سلول های پستانداران سمی است. هنگامی که سلول ها با موفقیت ترانسفکت شدند و با یک ژن مقاومت به نئومایسین (مانند ژن نئو) ادغام شدند، آمینوگلیکوزید فسفوترانسفراز رمزگذاری شده با ژن (APH (3) II) می تواند به طور کووالانسی G418 را تغییر دهد تا آن را غیرفعال کند و در نتیجه به سلول های رشد یافته در محیط انتخابی حاوی G418 مقاومت نشان دهد.

در آزمایش‌های ژنتیکی مولکولی، G418 یکی از رایج‌ترین موارد برای انتقال پایدار است.

2 کاربرد ژنومایسین

2.1 غربالگری خطوط سلولی ترانسفکت شده پایدار

از G418 برای غربالگری سلول‌های حاوی ژن‌های مقاومت (به عنوان مثال، ژن‌های neo) با مهار سنتز پروتئین استفاده شد. آمینوگلیکوزید فسفوترانسفراز کد گذاری شده توسط ژن مقاومت، G418 را غیرفعال می کند که مقاومت سلولی را به G418 می دهد. به طور معمول، محدوده غربالگری سلول پستانداران 200-2000 میکروگرم در میلی لیتر است، که بیشترین غلظت کاری مورد استفاده 100-700 میکروگرم در میلی لیتر است. در جایی که سلول های گیاهی 100-10 میکروگرم در میلی لیتر و سلول های مخمری 500-1000 میکروگرم در میلی لیتر هستند، غلظت های زیر برای برخی از انواع سلول ها با استفاده از G418 برای مرجع استفاده می شود.

سلول	برنامه	غلظت فعال سازی ژنومایسین (μg/mL)	آثار ذکر شده
گونه های موکور	الف) در محیط رشد کشت می شود ب) روی باکتری های لیوفیلیزه کشت می شود	الف) 10 میکروگرم در میلی لیتر ب) 30 میکروگرم در میلی لیتر	هیرت، و. آل.، Proc. Natl. آکادمی علمی، ج 79، 7356-7360 (1982).
پستانداران	الف) برای غربالگری ب) برای حفظ رشد	الف) 400-1000 میکروگرم در میلی لیتر ب) 200 میکروگرم در میلی لیتر	کنعانی و برگ، Proc. Natl. آکادمی علمی، ج 79، 5166-5170 (1982).
گیاه	الف) برای غربالگری ب) برای حفظ رشد	الف) 25-50 میکروگرم در میلی لیتر ب) 10 میکروگرم در میلی لیتر	اورسیک، و. آل.، بیوشیمی. بیوفیز. Res. کامنت، ج 101:3، 1031-1037 (1981).
مخمر	الف) برای غربالگری ب) برای حفظ رشد	الف) 500 میکروگرم در میلی لیتر ب) 200-125 میکروگرم بر میلی لیتر	خیمنز و دیویس، طبیعت، ج 287، 869-871 (1980).
باکتری ها	برای غربالگری	16 میکروگرم در میلی لیتر	وایتز و همکاران آل.، ضد میکروب. عوامل Chemother.، ج. 6:5، 579-581 (1974).

2.2 حذف ژن و انتقال ژن

در حذف ژن، از G418 می توان برای غربالگری سلول هایی که با موفقیت ژن هدف را ناک اوت می کنند، استفاده کرد. در انتقال ژن، G418 ادغام ژن های خارجی را در ژنوم سلول های میزبان تسهیل می کند.

2.3 انتخاب مقاومت در کشت سلولی

در طی کشت سلولی، از G418 برای غربالگری سلول‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک استفاده می‌شود که اغلب دارای ژن‌های مقاومت خاص هستند.

3 روش های تجربی مرتبط برای ژنومایسین

3.1 تهیه محلول استوک G418 (50 میلی گرم در میلی لیتر، غلظت فعال)

1) تبدیل واحدهای فعالیت

با استفاده از فرمول: (1000/A0) × A1 = A2 را تبدیل کنید، که در آن A0 قدرت G418 است که بسته به دسته متفاوت است. به گزارش کنترل کیفیت برای دسته مربوطه یا برچسب روی بطری مراجعه کنید. A1 غلظت فعال مورد نظر G418 است که باید تهیه شود. A2 غلظت واقعی پودر به حجم است که باید وزن شود.

به عنوان مثال، اگر دسته G418 دارای قدرت 750 U/mg باشد و بخواهید غلظت فعال 50 mg/mL را تهیه کنید، غلظت پودر واقعی برای تهیه 1000/750 × 50 mg/mL = 66.67 mg/mL است.

در صورت تهیه 10 میلی لیتر محلول استوک G418 (غلظت فعال 50 میلی گرم بر میلی لیتر)، 7/666 میلی گرم پودر مورد نیاز است.

استریلیزاسیون و ذخیره سازی

بر اساس وزن واقعی پودر حاصل از تبدیل فوق، آن را به 10 میلی لیتر آب استریل دیونیزه شده اضافه کنید تا کاملا حل شود.

ابتدا یک فیلتر سرنگ 0.22 میکرومتری را با 5 میلی لیتر آب استریل دیونیزه شده خیس کنید و تمام آب را خارج کنید. سپس با استفاده از این فیلتر فیلتر شده تا استریل شود و به حجم های کوچک برای یک بار مصرف (مثلاً 1 میلی لیتر) تقسیم شود و در دمای 20- درجه سانتیگراد برای یک سال پایداری نگهداری شود.

3.2 ایجاد منحنی کشتار

1) روز اول: سلول های تبدیل نشده را با تراکم 20 تا 25 درصد در پلیت های کشت مناسب قرار دهید و یک شبه در دمای 37 درجه سانتی گراد، CO انکوبه کنید.₂.

2) یک گرادیان غلظت را در محدوده مناسب بر اساس نوع سلول تنظیم کنید، حداقل 6 غلظت را انتخاب کنید (G418 در فاز تقسیم بیشتر در برابر سلول ها فعال است، بنابراین سلول ها باید قبل از افزودن G418 برای مدتی کشت شوند)، به عنوان مثال، برای سلول های پستانداران، 0، 50، 100، میکروگرم 200، 400، 1000، میکروگرم در لیتر، 0، 50، 100، 200، 400، 1000.

3) روز دوم: محیط کشت قدیمی را بردارید و با محیط تازه آماده شده حاوی غلظت مربوطه دارو، با سه تکرار برای هر غلظت جایگزین کنید.

4) هر 3-4 روز یکبار با محیط تازه حاوی دارو جایگزین کنید.

5) برای تعیین غلظت مناسب که از رشد سلول های ترانسفکت نشده جلوگیری می کند، شمارش سلول های زنده را در فواصل زمانی مشخص (مثلاً هر 2 روز یکبار) انجام دهید. کمترین غلظتی را که می تواند اکثر سلول ها را در تعداد روزهای ایده آل (معمولاً 10-7 روز) از بین ببرد، به عنوان غلظت کاری برای غربالگری رده سلولی ترانسفکت شده پایدار انتخاب کنید.

3.3 غربالگری سلول های ترانسفکت شده پایدار

G418 Geneticin (60220ES) ارائه شده توسط Yisheng Biotech دارای اثربخشی ≥720 U/mg، خلوص ~ 98٪ و پایداری دسته ای است و قیمتی نزدیک به یک سوم محصولات G418 سایر شرکت ها دارد.
محیط غربالگری حاوی داروها هر 3-4 روز یکبار تعویض می شد.
تشکیل کلون های سلولی (کلونی) پس از 7 روز انتخاب مشاهده و ارزیابی شد. بسته به نوع سلول میزبان، ترانسفکشن و کارایی غربالگری ممکن است تشکیل کلنی ها یک هفته یا بیشتر طول بکشد.
10-5 کلون مقاوم انتخاب شد و به صفحات کشت سلولی 35 میلی متری منتقل شد و سپس با محیط غربالگری حاوی دارو به مدت 7 روز نگهداری شد.
پس از تغییر محیط کشت معمولی.

4 توصیه محصول

G418 Geneticin (60220ES) توسط Yeasen ارائه شده است Biotech دارای اثربخشی ≥720 U/mg، خلوص ~ 98% و پایداری دسته‌ای است، با قیمتی نزدیک به یک سوم محصولات G418 سایر شرکت‌ها.

مشخصات	S*	T*	Yeasen	مزیت Yeasen
محتوا (HPLC)	/	/	~ 98٪	خلوص بالا
قدرت (U/mg)	≥720 میکروگرم در میلی گرم	707-721 میکروگرم بر میلی گرم	≥720 میکروگرم در میلی گرم	اثربخشی بالا
قیمت ($/5 گرم)	~ 1000	~ 1000	~ 200	ارزانی

5 مورد تجربی

در E. coli، G69 و G99 دو دسته متفاوت بودند. غلظت ژنومایسین به ترتیب 8 میلی گرم در لیتر، 12 میلی گرم در لیتر و 16 میلی گرم در لیتر و حداقل غلظت مؤثر 16 میلی گرم در لیتر بود که به طور کامل از رشد باکتری های متفرقه جلوگیری کرد.

شکل 1 تست پایداری و اعتبار سنجی غلظت های موثر ژنومایسین بین دسته های مختلف

6 موارد احتیاط

G418 نباید همراه با سایر آنتی بیوتیک ها / عوامل ضد قارچی (مانند پنی سیلین / استرپتومایسین) استفاده شود زیرا آنها مهارکننده های رقابتی G418 هستند. سایر آنتی بیوتیک ها نیز می توانند فعالیت متقابل ایجاد کنند.
هنگام تهیه محلول G418، باید با توجه به ارزش حیاتی (قدرت) مختلف دسته G418 تبدیل شود تا مایع ذخیره سازی و مایع کاری که نیاز به غلظت فعال دارد به دست آید.
این امکان وجود دارد که سلول‌های ترانسفکت نشده مکمل‌شده با G418 در سیستم کشت، به دلیل غلظت بسیار کم یا متراکم بودن دارو، کشته نشوند. از طرف دیگر، سلول‌هایی که به سرعت تقسیم می‌شوند، نسبت به سلول‌هایی که به آهستگی تکثیر می‌شوند، بیشتر از بین می‌روند. سلول های کنترل (ترانسفکت نشده) ممکن است پس از 5-7 روز از افزودن آنتی بیوتیک کشته نشوند و کلون های سلول های ترانسفکت شده (کلون های مقاوم) به 10-14 روز نیاز دارند تا تشکیل شوند.
حتی با دوز کشنده G418، سلول ها ممکن است به تقسیم 2 تا 3 بار ادامه دهند. اثربخشی G418 معمولاً پس از 2 روز آشکار می شود.

7 مقالات منتشر شده با معرف های ما

[1] لیو اس، ژانگ ایکس، یائو ایکس، وانگ جی، هوانگ اس، چن پی، تانگ ام، کای جی، وو زی، ژانگ یی، ژو آر، لیو ک، هه ک، وانگ یی، جیانگ ال، وانگ QA، روئی ال، لیو جی، لیو ی. پستانداران IRE1α به صورت پویا و عملکردی با تنش ترکیب می‌شوند. Nat Cell Biol. 2024 ژوئن؛ 26 (6): 917-931. doi: 10.1038/s41556-024-01418-7. (IF: 21.3)

[2] Tan K، Mo J، Li M، Dong Y، Han Y، Sun X، Ma Y، Zhu K، Wu W، Lu L، Liu J، Zhao K، Zhang L، Tang Y، Lv Z. حلقه بازخورد مثبت SMAD9-MYCN یک وابستگی منحصر به فرد برای نوروبلاستوم تقویت شده با MYCN است. J Exp Clin Cancer Res. 2022 دسامبر 20; 41 (1): 352. doi: 10.1186/s13046-022-02563-3.(IF: 11.3)

8 محصولات مرتبط

نام محصول	گربه#	مشخصات
سیپروفلوکساسین هیدروکلراید	60201ES05/25/60	5/25/100 گرم
آمپی سیلین، نمک سدیم	60203ES10/60	10/100 گرم
داکسی سایکلین هیکلات	60204ES03/08/25	1/5/25 گرم
کلرامفنیکل، درجه USP	60205ES08/25/60	5/25/100 گرم
کانامایسین سولفات	60206ES10/60	10/100 گرم
تتراسایکلین HCl تتراسایکلین هیدروکلراید (USP)	60212ES25/60	25/100 گرم
وانکومایسین هیدروکلراید	60213ES60/80/90	100 میلی گرم / 1 گرم / 5 گرم
نمک سولفات جنتامایسین	60214ES03/08/25	1/5/25 گرم
اسپکتینومایسین هیدروکلراید	60215ES08	5 گرم
فلئومایسین (20 میلی گرم در میلی لیتر در محلول)	60217ES20/60	20/5×20 میلی گرم
بلاستیسیدین S (بلاستیسیدین)	60218ES10/60	10/10×10 میلی گرم
نیستاتین	60219ES08	5 گرم
سولفات G418 (ژنتیکین)	60220ES03/08	1/5 گرم
پورومایسین (محلول 10 میلی گرم در میلی لیتر)	60209ES10/50/60/76	1 × 1 / 5 × 1 / 1 0 × 1 / 50 × 1 میلی لیتر
پورومایسین دی هیدروکلراید	60210ES25/60/72/76/80	25/100/250/500 میلی گرم / 1 گرم
هیگرومایسین B (50 میلی گرم در میلی لیتر)	60224ES03	1 گرم (20 میلی لیتر)/10×1 گرم (20 میلی لیتر)
هیگرومایسین B	60225ES03/10	1/10 گرم
اریترومایسین	60228ES08/25	5/25 گرم
تیمنتین	60230ES07/32	3.2/10×3.2 گرم
اورئوباسیدین A (AbA)	60231ES03/08/10	1/5×1/10×1 میلی گرم
سولفات پلی میکسین B	60242ES03/10	1/10 MU

مقاله قبلی مقاله بعدی

کاربردهای ژنتیکین (G418)