1 Aاصل عمل

هیگرومایسین B یک آنتی بیوتیک آمینوگلیکوزید است که توسط متابولیسم Streptomyces hygroscopicus تولید می شود که با ایجاد اختلال در جابجایی و ترویج اشتباه خواندن ریبوزوم های 80S، سنتز پروتئین را مهار می کند و در نتیجه سلول های پروکاریوتی و یوکاریوتی را از بین می برد.

در حال حاضر، معمولاً برای غربالگری و نگهداری سلول های پروکاریوتی یا یوکاریوتی حاوی ژن مقاومت هیگرومایسین استفاده می شود.

2 کاربرد

2.1 غربالگری و حفظ کشت سلول های پروکاریوتی یا یوکاریوتی (سلول های گیاهی و سلول های پستانداران) که به طور پایدار با Hph ترانسفکت شده اند.+بردارها

هیگرومایسین ب ژن مقاومت (hyg یا hph) مشتق شده از اشریشیا کلی. هیگرومایسین B فسفوترانسفراز را کد می کند، که هیگرومایسین B را به یک محصول فسفریله شده بیولوژیکی غیرفعال تبدیل می کند و در نتیجه سم زدایی می کند. با توجه به این اصل، هیگرومایسین B یک نشانگر قابل انتخاب بسیار مفید برای غربالگری و حفظ سلول های پروکاریوتی یا یوکاریوتی کشت شده است که با موفقیت با ژن مقاومت به هیگرومایسین ترانسفکت شده اند.

2.2 به دلیل تفاوت در نحوه عملکرد، هیگرومایسین B اغلب در ترکیب با ژنتیکین G418، بلئومایسین و بلاستیسیدین برای غربالگری رده های سلولی که به طور پایدار با دو ناقل مختلف ترانسفکت شده اند استفاده می شود.

هیگرومایسین B نسبت به G418 (Cat#60220ES)، بلئومایسین (Cat#60257ES) عملکرد متفاوتی دارد. و Blasticidins (Cat#60218ES)، بنابراین برای استفاده در ترکیب با سایر آنتی بیوتیک های انتخابی در آزمایش های انتخاب دوگانه مناسب است.

2.3 عامل ضد ویروسی
2.4 به عنوان یک ضد کرم، به خوراک دام اضافه می شود و حیوانات پرورش می یابند.
2.5 غربالگری سلول های ترانسفکت شده پایدار

غلظت کاری هیگرومایسین B که برای غربالگری ترانسفکتنت های پایدار استفاده می شود بسته به نوع سلول، محیط، شرایط رشد و سرعت متابولیسم سلولی متفاوت است. غلظت توصیه شده 50-1000 میکروگرم در میلی لیتر است. برای اولین استفاده از سیستم تجربی، توصیه می شود که غلظت غربالگری بهینه با ایجاد یک منحنی کشتن، یعنی منحنی دوز-پاسخ تعیین شود. به طور کلی، 50-500 میکروگرم در میلی لیتر برای سلول های پستانداران. 200-200 میکروگرم در میلی لیتر برای باکتری/سلول های گیاهی؛ 200-1000 میکروگرم در میلی لیتر برای قارچ ها.

3 پروتکل

3.1 تهیه محلول نگهداری (50 میلی گرم در میلی لیتر)

0.5 گرم هیگرومایسین B وزن کرده و 10 میلی لیتر 1×PBS، pH 7.4 به آن اضافه کنید. پس از حل شدن کامل، با فیلتر 0.22 میکرومتر برای استریلیزاسیون فیلتر کنید. محلول استریل شده را به مقدار کم مصرف کنید و در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری کنید.

3.2 معمولاً از غلظت غربالگری استفاده می شود

غلظت کاری هیگرومایسین B برای غربالگری سویه های پایدار با توجه به نوع سلول، محیط کشت، شرایط رشد و سرعت متابولیسم سلولی متفاوت است. توصیه می شود برای تعیین غلظت غربالگری بهینه برای اولین بار، یک منحنی کشتن (منحنی دوز-پاسخ) ایجاد کنید. به طور کلی، سلول های پستانداران: 50-500 میکروگرم در میلی لیتر. سلول های باکتریایی/گیاهی: 20-200 میکروگرم در میلی لیتر؛ قارچ: 300-1000 میکروگرم در میلی لیتر.

3.3 ایجاد منحنی کشتار

【نکته】به منظور غربال رده های سلولی پایدار، تعیین حداقل غلظت آنتی بیوتیک هایی که قادر به کشتن سلول های میزبان ترانسفکت نشده هستند ضروری است. این را می توان با ایجاد یک منحنی کشتار (منحنی دوز-پاسخ) به دست آورد. حداقل پنج غلظت باید مرتب شود.

1) روز 1: سلول های تبدیل نشده در یک صفحه کشت مناسب با تراکم سلولی 20-25 درصد قرار می گیرند و یک شبه کشت می شوند.【توجه】 مقدار سلول های تلقیح را می توان برای سلول هایی که برای تشخیص حیات نیاز به تراکم بالاتری دارند افزایش داد.

2) گرادیان غلظت را با توجه به نوع سلول در محدوده مناسب تنظیم کنید. سلول پستانداران می تواند 50، 100، 250، 500، 750، 1000 میکروگرم در میلی لیتر را تنظیم کند. محلول هیگرومایسین B را به نسبت 1:10 با آب دیونیزه یا بافر PBS تا 5 میلی گرم بر میلی لیتر رقیق کنید. و سپس طبق جدول زیر محلول را به غلظت کاری مربوطه رقیق کنید.

غلظت نهایی (μg/mL)	حجم متوسط ​​(میلی لیتر)	افزایش حجم 5 میلی گرم در میلی لیتر هیگرومایسین B (میلی لیتر)
50	9.9	0.1
100	9.8	0.2
250	9.5	0.5
500	9.0	1.0
750	8.5	1.5
1000	8.0	2.0

3) روز 2: با یک محیط تازه آماده شده حاوی غلظت متناظر دارو جایگزین کنید. برای هر غلظت سه نمونه موازی تهیه کنید.

4) هر 3-4 روز یکبار با محیط های تازه حاوی دارو جایگزین کنید.

5) شمارش سلول های زنده در یک چرخه ثابت (مثلاً هر 2 روز یکبار) انجام می شود تا غلظت مناسب برای جلوگیری از رشد سلول های ترانسفکت نشده تعیین شود. حداقل غلظتی را انتخاب کنید که اکثر سلول ها را در یک تعداد ایده آل روز (معمولاً 10-7 روز) از بین می برد، به عنوان غلظت کاری برای غربالگری رده سلولی پایدار.

3.4 غربالگری سلول های ترانسفکت شده پایدار

1) 48 ساعت پس از ترانسفکشن، سلول ها با محیط غربالگری حاوی هیگرومایسین B در غلظت مناسب (مستقیم یا رقیق) زیر کشت شدند. 【نکته】آنتی بیوتیک ها در تقسیم فعال سلول ها بهترین عملکرد را دارند. اگر سلول ها خیلی متراکم باشند، آنتی بیوتیک سلول ها را از بین نمی برد. سلول ها را به گونه ای تقسیم کنید که سلول ها بیش از 25٪ به هم متصل نباشند.

2) محیط غربالگری را هر 3-4 روز یکبار تغییر دهید.

3) تشکیل کلونی سلولی را پس از 7 روز غربالگری اندازه گیری کنید. تشکیل کلنی ممکن است یک هفته دیگر یا بیشتر طول بکشد، بسته به نوع سلول میزبان، ترانسفکشن و اثربخشی غربالگری.

4) 5-10 کلون مقاوم را انتخاب کنید و به صفحات کشت سلولی 35 میلی متری منتقل کنید و در محیط غربالگری حاوی دارو به مدت 7 روز کشت کنید.

5) با محیط تازه بدون دارو برای کشت جایگزین کنید.

4 خواص

هیگرومایسین B پودری سفید متمایل به قهوه ای مایل به زرد با بوی خاص است که به راحتی در آب، متانول، اتانول و ... حل می شود و به راحتی با بسیاری از اسیدهای آلی و معدنی نمک تشکیل می دهد.

5 ذخیره سازی محصول

محلول را می توان مستقیماً در دمای 2 ~ 8 درجه سانتیگراد نگهداری کرد و می توان آن را برای بیش از 6 ماه نگهداری کرد.

6 احتیاط

1) سلول های ترانسفکت شده با ژن hph به هیگرومایسین مقاوم هستند و سلول های ترانسفکت شده ژن را به طور پایدار یا موقت بیان می کنند.

2) ژن مقاومت هیگرومایسین B (hyg یا hph) در سویه‌های دیگر، از جمله Streptomyces hygroscopicus و Klebsiella pneumoniae، علاوه بر E.Coli یافت شد.

7 توصیه محصول

Yeasen فراهم می کند هیگرومایسین B به دو شکل پودر (1 گرم در 10 گرم، Cat#60225ES) و محلول (50 میلی گرم در میلی لیتر، Cat#60224ES).

نام محصول	گربه#	مشخصات
هیگرومایسین B (50 میلی گرم در میلی لیتر)	60224ES03	1 گرم (20 میلی لیتر)
	60224ES10	10×1 گرم (20 میلی لیتر)
هیگرومایسین B	60225ES03	1 گرم
	60225ES10	10 گرم

8 مقاله منتشر شده با معرف های ما

[1] ژائو کیو، ژنگ کی، ما سی، و همکاران. PTPS تقسیم‌بندی LTBP1 S-Nitrosylation را تسهیل می‌کند و باعث رشد تومور در شرایط هیپوکسی می‌شود. سلول مول . 2020؛ 77 (1): 95-107.e5. doi:10.1016/j .molcel.2019.09.018 (IF: 14.548)

[2] Wu LY، Shang GD، Wang FX، و همکاران. پروفایل پویا حالت کروماتین نقش تنظیمی اکسین و سیتوکینین را در بازسازی شاخساره نشان می دهد. Dev Cell . 2022؛ 57 (4): 526-542.e7. doi:10.1016/ j.devcel.2021.12.019 (IF: 12.270)
[3] Zhang TQ، Chen Y، Wang JW. تجزیه و تحلیل تک سلولی راس شاخه رویشی آرابیدوپسیس. Dev Cell . 2021؛ 56 (7): 1056-1074. e8. doi:10.1016/j.devcel.2021.02.021 (IF: 12.270)
[4] Wang FX، Shang GD، Wu LY، Xu ZG، Zhao XY، Wang JW. دینامیک دسترسی کروماتین و ساختار شبکه تنظیمی رونویسی سلسله مراتبی برای جنین زایی سوماتیک گیاهی. Dev Cell . 2020؛ 54 (6): 742-757.e8. doi:10.1016/j.devcel.2020.07.003 (IF: 10.092)

[5] Zhu GD، Yu J، Sun ZY، و همکاران. غربالگری CRISPR/Cas9 در کل ژنوم، CARHSP1 را مسئول مقاومت در برابر تشعشع در گلیوبلاستوما شناسایی می کند. سلول مرگ دیس . 2021؛ 12 (8): 724. منتشر شده در 21 ژوئیه 2021. doi :10.1038/s41419-021-04000-3 (IF: 8.469)
[6] Chen J، Huang Y، Tang Z، و همکاران. غربالگری فعال سازی رونویسی با مقیاس ژنومی CRISPR-Cas9 در ژن سرطان پروستات مرتبط با مقاومت متفورمین. Front Cell Dev Biol . 2021؛ 8:616332. منتشر شده در 26 ژانویه 2021. doi:10.3389/fcell.2020.616332 (IF: 6.684)
[7] Jiang Z، Cui Z، Zhu Z، و همکاران. مهندسی انتقال دهنده های Yarrowia lipolytica برای تولید با کارایی بالا اسید سوکسینیک زیستی از گلوکز. سوخت های زیستی بیوتکنول . 2021؛ 14 (1): 145. منتشر شده در 27 ژوئن 2021. doi:10.1186/s13068-021-01996-w (IF: 6.040)
[8] Liu Y، Jiang X، Cui Z، Wang Z، Qi Q، Hou J. مهندسی مخمر روغنی Yarrowia lipolytica برای تولید α-فارنسن. سوخت های زیستی بیوتکنول . 2019؛ 12:296. منتشر شده در 23 دسامبر 2019. doi:10.1186/s13068-019-1636-z (IF: 5.452)
[9] Zhou C، Zeng Z، Suo J، و همکاران. دستکاری یک عامل رونویسی منفرد، Ant1، تجمع آنتوسیانین را در دانه های جو ترویج می کند. J Agric Food Chem . 2021؛ 69 (18): 5306-5317. doi:10.1021/acs.jafc.0c08147 (IF: 5.279)

[10] Cui Z، Zheng H، Jiang Z، و همکاران.شناسایی و خصوصیات منشا تکرار میتوکندری برای بیان پایدار و اپیزومی در Yarrowia lipolytica. ACS Synth Biol . 2021؛ 10 (4): 826-835. doi:10.1021 /acssynbio.0c00619 (IF: 5.110)

9 محصولات مرتبط

نام محصول	گربه#	مشخصات
سیپروفلوکساسین هیدروکلراید	60201ES05/25/60	5/25/100 گرم
آمپی سیلین، نمک سدیم	60203ES10/60	10/100 گرم
داکسی سایکلین هیکلات	60204ES03/08/25	1/5/25 گرم
کلرامفنیکل، درجه USP	60205ES08/25/60	5/25/100 گرم
کانامایسین سولفات	60206ES10/60	10/100 گرم
تتراسایکلین HCl تتراسایکلین هیدروکلراید (USP)	60212ES25/60	25/100 گرم
وانکومایسین هیدروکلراید	60213ES60/80/90	100 میلی گرم / 1 گرم / 5 گرم
نمک سولفات جنتامایسین	60214ES03/08/25	1/5/25 گرم
اسپکتینومایسین هیدروکلراید	60215ES08	5 گرم
فلئومایسین (20 میلی گرم در میلی لیتر در محلول)	60217ES20/60	20/5×20 میلی گرم
بلاستیسیدین S (بلاستیسیدین)	60218ES10/60	10/10×10 میلی گرم
نیستاتین	60219ES08	5 گرم
سولفات G418 (ژنتیکین)	60220ES03/08	1/5 گرم
پورومایسین (محلول 10 میلی گرم در میلی لیتر)	60209ES10/50/60/76	1 × 1 / 5 × 1 / 1 0 × 1 / 50 × 1 میلی لیتر
پورومایسین دی هیدروکلراید	60210ES25/60/72/76/80	25/100/250/500 میلی گرم / 1 گرم
هیگرومایسین B (50 میلی گرم در میلی لیتر)	60224ES03	1 گرم (20 میلی لیتر)/10×1 گرم (20 میلی لیتر)
هیگرومایسین B	60225ES03/10	1/10 گرم
اریترومایسین	60228ES08/25	5/25 گرم
تیمنتین	60230ES07/32	3.2/10×3.2 گرم
اورئوباسیدین A (AbA)	60231ES03/08/10	1/5×1/10×1 میلی گرم
سولفات پلی میکسین B	60242ES03/10	1/10 MU