آپوپتوز به طور کلی به نوعی مرگ برنامه ریزی شده سلولی اطلاق می شود که از طریق تنظیم ژن های درون سلولی و محصولات آن ها در طول رشد سلول ها یا تحت تأثیر برخی عوامل رخ می دهد. آپوپتوز نقش مهمی در رشد و مورفوژنز جنین، پایداری جمعیت های سلولی طبیعی در بافت ها، پاسخ دفاعی و ایمنی بدن، آسیب سلولی و پیری ناشی از بیماری یا مسمومیت و بروز و پیشرفت تومورها دارد و دارای اهمیت درمانی بالقوه است.

رویدادها در مسیر آپوپتوز در یک توالی زمانی رخ می‌دهند، یعنی رویدادها به ترتیب رخ می‌دهند و در نهایت منجر به پیدایش اجسام آپوپتوز، با وقوع آپوپتوز می‌شوند.

خصوصیات معمول آن به شرح زیر است:

1. آپوپتوز اولیه: تغییر ساختار غشای سلولی، تغییر فسفاتیدیل سرین.

2. آپوپتوز در مراحل اولیه و میانی: تراکم سیتوپلاسم افزایش یافت، پتانسیل غشای میتوکندری ناپدید شد، نفوذپذیری تغییر کرد و سیتوکروم C در سیتوپلاسم آزاد شد.

3. آپوپتوز دیررس: انتقال سیگنال آپوپتوز.

4. آپوپتوز دیررس: DNA به اندازه قطعه 180 تا 200 جفت باز تجزیه می شود.

شکل 1: وقوع و تشخیص رویدادهای متوالی در مسیر آپوپتوز

1. آپوپتوز اولیه: Annexin-V/PI رنگ آمیزی مضاعف (تشخیص PS روی غشای خارج سلولی)

در سلول های زنده طبیعی، فسفاتیدیل سرین (PS) در سمت داخلی غشای سلولی قرار دارد. هنگامی که آپوپتوز رخ می دهد، غشای سلولی تغییر می کند و PS از سطح داخلی غشای سلولی به سطح بیرونی غشای سلولی می چرخد. Annexin-V یک پروتئین متصل به فسفولیپید وابسته به Ca2+ با وزن مولکولی 35-36 KD است که می تواند با PS با میل ترکیبی بالا متصل شود. با استفاده از Annexin-V نشاندار شده با فلورسئین (FITC، Alexa fluor488، و غیره) به عنوان یک پروب، سلول های آپوپتوز و سلول های زنده را می توان با فلوسیتومتری یا میکروسکوپ فلورسانس شناسایی کرد.

PS سلول های نکروزه نیز از سطح داخلی غشای سلولی به سطح بیرونی غشای سلولی تبدیل می شود. Annexin-V همچنین می تواند PS را در سطح سلول های نکروز تشخیص دهد، بنابراین Annexin-V نمی تواند سلول های نکروزه را از سلول های آپوپتوز تشخیص دهد. علاوه بر این، پروپیدین یدید (PI) یک رنگ اسید نوکلئیک است که می تواند به DNA در سلول ها متصل شود و نمی تواند به غشای کامل سلول نفوذ کند. غشای سلولی سلول‌های آپوپتوز اولیه و سلول‌های زنده هنوز دست نخورده است و رنگ PI نمی‌تواند آزادانه از طریق غشای سلولی وارد سلول شود تا با DNA متصل شود، بنابراین رنگ PI نمی‌تواند سلول‌های آپوپتوز و سلول‌های زنده را برچسب‌گذاری کند، اما رنگ PI می‌تواند با DNA موجود در سلول از طریق غشای سلولی سلول‌های نکروزه متصل شود. رنگ PI در سلول‌های مرده پس از تحریک توسط لیزر 488 نانومتری فلورسانس قرمز منتشر می‌کند و توسط کانال مربوطه دریافت می‌شود. بنابراین، Annexin V و PI را می توان با هم برای تشخیص سلول های زنده، سلول های آپوپتوز اولیه و سلول های نکروزه استفاده کرد.

شکل 2: تجزیه و تحلیل نتایج فلوسیتومتری پس از رنگ آمیزی دوگانه annexin-v/pi

سفارش محصولات:

2. آپوپتوز اولیه: رنگ آمیزی JC-1 (تشخیص تغییرات پتانسیل غشای میتوکندری)

فرآیند آپوپتوز اغلب با تخریب پتانسیل گذرنده میتوکندری همراه است، که به طور گسترده به عنوان یکی از اولین رویدادها در روند آبشار آپوپتوز در نظر گرفته می شود. قبل از ظهور ویژگی های آپوپتوز هسته ای (غلظت کروماتین، شکستن DNA) رخ می دهد. هنگامی که پتانسیل گذرنده میتوکندری فرو می ریزد، آپوپتوز سلولی برگشت ناپذیر است. وجود پتانسیل گذرنده میتوکندری باعث می شود برخی از رنگ های فلورسنت کاتیونی چربی دوست مانند رودامین 123، JC-1، JC-10 به ماتریکس میتوکندری متصل شوند. افزایش یا کاهش فلورسانس آنها نشان دهنده افزایش یا کاهش الکترونگاتیوی غشای داخلی میتوکندری است.

JC-1 به طور گسترده برای تشخیص پتانسیل غشای میتوکندری △ΨM استفاده می شود، که تجمع وابسته به پتانسیل را در میتوکندری نشان می دهد. در میتوکندری های معمولی، JC-1 در ماتریکس میتوکندری تجمع می یابد و پلیمری را تشکیل می دهد که فلورسانس قرمز قوی ساطع می کند (585 نانومتر سابق، 590 نانومتر em =). در سلول‌های آپوپتوز، پتانسیل گذرنده میتوکندری دپلاریزه شد، JC-1 از میتوکندری آزاد شد، غلظت کاهش یافت و به شکل مونومر که فلورسانس سبز منتشر می‌کرد، برگشت. بنابراین، تغییر رنگ به طور مستقیم تغییر در پتانسیل غشای میتوکندری را منعکس می کند. درجه دپلاریزاسیون میتوکندری را می توان با نسبت شدت فلورسانس قرمز/سبز اندازه گیری کرد. تشخیص JC-1 یک روش رایج است.

3. آپوپتوز دیررس: روش TUNEL (روش برچسب گذاری در محل قطعه DNA)

در مرحله پایانی آپوپتوز، تعداد زیادی پایانه چسبنده 3-OH به دلیل شکستگی دو رشته ای یا شکستگی تک رشته ای DNA کروموزومی تولید می شود. تحت عمل ترانسفراز ترمینال دئوکسی ریبونوکلئوتید (TdT)، dUTP نشاندار شده با لوسیفراز را می توان به پایانه 3 DNA متصل کرد، به طوری که سلول های آپوپتوز را می توان تشخیص داد، چنین روش هایی را با واسطه دئوکسی نوکلئوتیدیل ترانسفراز با واسطه dUTP nick end labeling (TUNEL) می نامند. از آنجایی که سلول‌های طبیعی یا در حال تکثیر تقریباً هیچ شکسته‌ای در DNA ندارند، 3-OH تشکیل نمی‌شود و تعداد کمی می‌توانند رنگ‌آمیزی شوند. TUNEL در واقع یک روش تحقیقاتی است که ترکیبی از بیولوژی مولکولی و مورفولوژی است. رنگ آمیزی درجا از یک هسته کامل آپوپتوز یا بدن آپوپتوز می تواند به طور دقیق ویژگی های بیوشیمیایی و مورفولوژیکی آپوپتوز را منعکس کند. می توان از آن برای تعیین مورفولوژی سلولی مقاطع بافتی تعبیه شده با پارافین، بخش های بافت منجمد، سلول های کشت شده و سلول های جدا شده از بافت ها استفاده کرد و می تواند تعداد بسیار کمی از سلول های آپوپتوز را شناسایی کند، بنابراین در مطالعه آپوپتوز به طور گسترده ای استفاده می شود.

محصولات مرتبط: