دئوکسی ریبونوکلئاز I (DNase I) یک اندونوکلئاز است، کاربرد آن نه تنها برای حفظ یکپارچگی RNA بلکه برای تجزیه و تحلیل ردپای DNA، تولید کتابخانه های تصادفی DNA، کاهش چسبندگی در لیزات سلولی یا عصاره های پروتئینی و غیره است. در یک کلام، DNase I را می توان تقریباً در هر کاربردی که نیاز به برش آنزیمی دارد استفاده کرد. در ادامه به معرفی دقیق DNase I و کاربرد خاص آن می پردازیم.

1. DNase I چیست؟
2. DNase I برای تهیه استخراج RNA بدون DNA
3. DNase I برای رونویسی in vitro برای حذف DNA الگو
4. DNase I برای حذف rRNA
5. DNase I برای برچسب گذاری DNA
6. برنامه های کاربردی دیگر
7. راهنمای انتخاب محصول DNase I

1. DNase I چیست؟

دئوکسی ریبونوکلئاز I (DNase I) یک اندونوکلئاز غیر اختصاصی است که می تواند DNA تک یا دو رشته ای را هضم کند که در بافت ها و مایعات مختلف بدن وجود دارد. این می تواند پیوندهای فسفودی استر را برای تولید تک و الیگودئوکسی نوکلئوتیدهای حاوی یک گروه 5'-فسفات و یک گروه 3'-OH هیدرولیز کند. محدوده pH کاری بهینه DNase I 7-8 است، فعالیت آن به Ca2+ بستگی دارد و می‌تواند توسط یون‌های فلزی دو ظرفیتی مانند Mn2+، Mg2+، Zn2+ و غیره فعال شود. در حضور Mn2+، DNase I می‌تواند DNA دو رشته‌ای را در همان محل برش دهد تا یک انتهای صاف تشکیل دهد یا انتهای چسبنده 1-2 نوکلئوتیدی به‌وجود آید.

شکل 1. نمودار شماتیک برش dsDNA توسط DNase I در حضور Mg2+ و Mn2+.

اگرچه شکاف های DNase I به طور کلی به عنوان شکاف های غیر اختصاصی در نظر گرفته می شوند، DNase I به احتمال زیاد روی قطعات توالی خاصی مانند ناحیه شیار کوچک عمل می کند و بیشتر مستعد برش توالی های پورین-پیرمیدین است. با این حال، هنگامی که DNase I بر روی dsDNA ناهمگن عمل می کند، هر چهار پایه بریده می شوند و تأثیر آن بر روی یک پایه خاص بیش از 3 برابر بیشتر از سایر بازها نخواهد بود.

2. DNase I برای تهیه استخراج RNA بدون DNA

در آزمایش‌های بیولوژیکی، اولین مرحله آماده‌سازی اسید نوکلئیک برای مطالعه عملکردهای مختلف RNA است. با این حال، از آنجایی که DNA و RNA اغلب در طول فرآیند لیز سلولی با هم آزاد می شوند، صرف نظر از اینکه از چه محلول استخراجی استفاده می شود، نمی توان از تداخل در این دو اجتناب کرد، بنابراین باید از آنزیم های خاصی برای حذف تداخل استفاده شود. برای استخراج RNA با کیفیت بالا، از DNase I برای حذف DNA باقیمانده از نمونه استفاده می شود.

DNase I می تواند DNA دو رشته ای و تک رشته ای را به الیگونوکلئوتیدها و تک نوکلئوتیدها تجزیه کند و DNA موجود در محصول آماده سازی RNA را می توان به طور موثر تجزیه کرد. سپس DNase I با حرارت دادن با یک بافر توقف غیرفعال می شود. در طول فرآیند گرمایش، ساختار سنجاق موی مولکول RNA را می توان باز کرد، که ورود مستقیم RNA به فرآیند رونویسی معکوس را تسهیل می کند.
کیفیت RNA به طور مستقیم بر داده های تجربی تا حد زیادی تأثیر می گذارد. به طور کلی، در طول استخراج RNA نمی توان به طور کامل از باقی مانده های gDNA اجتناب کرد، بنابراین، به طور کلی توصیه می شود که نمونه های RNA را با DNase I برای هضم gDNA باقیمانده قبل از به چالش کشیدن کاربردهای پایین دستی (مانند تجزیه و تحلیل بیان mRNA، تجزیه و تحلیل رونوشت و غیره) درمان کنید. مرحله هضم gDNA را می توان در طول استخراج RNA، پس از استخراج RNA یا قبل از رونویسی معکوس RNA انجام داد.با توجه به جایگاه محصول، محصولات ارائه شده توسط Yeasen به شرح زیر است:

جدول 1: فهرست محصولات مربوط به حذف DNA از استخراج RNA یا قبل از رونویسی معکوس

3. DNase I برای رونویسی in vitro برای حذف DNA الگو

رونویسی در شرایط آزمایشگاهی (IVT) عمدتا از DNA به عنوان یک الگو، به علاوه سوبستراها و بافرهای مربوطه برای به دست آوردن RNA از طریق رونویسی آزمایشگاهی استفاده می کند. در آزمایش‌های رونویسی آزمایشگاهی، RNA پلیمرازها مانند T7، T3 و SP6 معمولاً برای سنتز RNA استفاده می‌شوند. RNA سنتز شده ممکن است دارای بقایای DNA باشد. از بین بردن باقی مانده های DNA برای توسعه آزمایش های پایین دست مفید است. به عنوان مثال، در مرحله توسعه واکسن mRNA، حذف باقیمانده ها یک مرحله حیاتی است که می تواند دشواری خالص سازی پایین دستی را کاهش دهد و خلوص محصول را افزایش دهد. الگوی DNA معمولاً با استفاده از DNase نوترکیب I (بدون RNase) حذف می شود.با توجه به فرآیند سنتز mRNA، محصولات ارائه شده توسط Yeasen به شرح زیر است: