دانشمندان از کدام آنزیم ها برای اتصال یک ژن جدید استفاده می کنند؟ نیازی به گفتن نیست، DNA لیگاز شامل می شود. پس چرا DNA لیگاز در DNA نوترکیب بسیار مهم است؟ زیرا DNA لیگاز وظیفه بستن قطعه هدف به وکتور را بر عهده دارد که یکی از عناصر کلیدی تعیین کننده موفقیت آزمایش است. به عنوان نوعی از DNA لیگاز، T4 DNA لیگاز چه نقشی در آزمایش های شبیه سازی مولکولی دارد؟ چگونه کار می کند؟ T4 DNA لیگاز بعدی به طور کامل معرفی خواهد شد.

1. T4 DNA Ligase چیست؟
2. وظیفه DNA لیگاز T4 چیست؟
3. Yeasen Biotech T4 DNA لیگاز را می توان برای بستن آداپتور NGS استفاده کرد
4. راهنمای انتخاب Yeasen Biotech T4 DNA ligase

1. T4 DNA Ligase چیست؟

T4 DNA لیگاز یک لیگاز وابسته به ATP است که واکنش بستن بین مولکول های DNA را کاتالیز می کند. عمدتاً با پیوند دادن انتهای 3'-هیدروکسیل و 5'-فسفات، فسفودی استر را تشکیل می دهد. لیگازهای DNA در تکثیر DNA و فرآیندهای ترمیم در همه موجودات نقش دارند. لیگاز DNA T4 رمزگذاری شده با فاژ در طی عفونت فاژ T4 E. coli تولید می شود.
لیگازهای مورد استفاده در مهندسی ژنتیک عمدتاً E. coli DNA لیگاز و T4 DNA لیگاز هستند که مورد دوم در حال حاضر بیشتر مورد استفاده قرار می گیرد. T4 DNA لیگاز می تواند شکاف های تک رشته ای روی DNA دو رشته ای، RNA دو رشته ای یا رشته های هیبریدی DNA/RNA را برای اتصال دو نوکلئوتید مجاور ترمیم کند و نقش مهمی در ترمیم و نوترکیب DNA ایفا می کند.
در فرآیند ساخت پلاسمید نوترکیب، T4 DNA لیگاز را می توان همراه با آنزیم های محدود کننده برای تکمیل آزمایش ساخت پلاسمید نوترکیب استفاده کرد. این می تواند تشکیل یک پیوند فسفودی استر را بین انتهای 5'-P و انتهای 3'-OH DNA دو رشته ای کاتالیز کند و کارایی اتصال خوبی برای اتصال انتهای چسبنده و اتصال انتهایی بلانت دارد.

شکل 1. مکانیسم dna لیگاز T4

2. وظیفه DNA لیگاز T4 چیست؟

2.1 ساخت وکتور

در آزمایش‌های ساخت وکتور، آنزیم‌های محدودکننده مختلف می‌توانند انواع مختلفی از انتهای را تولید کنند. برای اهداف مختلف، T4 DNA لیگاز استراتژی های بستن متفاوتی خواهد داشت.

2.1.1 شبیه سازی با آنزیم های محدود کننده، انتهای چسبنده تولید شده توسط یک هضم

در طول ساخت وکتور، اگر از همان اندونوکلئاز محدود کننده برای برش قطعه DNA ژن هدف استفاده شود و مولکول ناقل بتواند همان انتهای چسبنده را ایجاد کند، لیگاز DNA T4 می تواند مستقیماً اتصال نوترکیبی را انجام دهد. با این حال، از آنجایی که انتهای چسبنده یکسان است، ژن هدف را می توان در جهت جلو یا معکوس وارد ناقل کرد، که به راحتی بار کاری غربالگری برای کلون های نوترکیب صحیح را افزایش می دهد. استفاده از روش هضم دو آنزیمی را برای ساخت وکتور در نظر بگیرید.
علاوه بر این، انتهای منسجم ناقل تهیه شده توسط هضم تک آنزیمی نیز می تواند جفت شود، و سپس پیوندهای فسفودی استر بین نوکلئوتیدها تحت تأثیر T4 DNA لیگاز تشکیل می شود که منجر به خود بستن ناقل می شود. استفاده از آلکالین فسفاتاز برای درمان ناقل هضم شده می تواند گروه فسفات را در انتهای 5' ناقل حذف کند تا ناقل نتواند خود بستن را کامل کند. بنابراین، تحت عمل T4 DNA لیگاز، ناقل و قطعه هدف به هم متصل می شوند تا ساخت وکتور نوترکیب تکمیل شود.

2.1.2 شبیه سازی با آنزیم های محدود کننده، انتهای چسبنده تولید شده توسط دو هضم

در فرآیند ساخت وکتور، اگر از دو آنزیم محدود کننده با انتهای چسبنده مختلف به ترتیب برای هضم قطعه هدف و بردار استفاده شود، می توان دو انتهای چسبنده متفاوت تولید کرد. در این مرحله، T4 DNA لیگاز می تواند به طور انتخابی همان انتهای چسبنده را به هم متصل کند تا اطمینان حاصل شود که قطعه هدف در جهت صحیح وارد ناقل می شود. هنگامی که قطعه هدف و بردار در شکل 2 با EcoR I و BamH I به طور همزمان هضم شوند، می توان همان انتهای چسبنده را به هم متصل کرد. فقط یک جهت بستن بین قطعه هدف و ناقل وجود دارد.

شکل 2. بستن انتهای چسبنده که توسط هضم دو آنزیمی ایجاد می شود^[1]

2.1.3 کلون کردن قطعات محدودکننده، انتهای بی‌نقص

برخی از اندونوکلئازهای محدودکننده نیز می‌توانند در طی برش‌های آنزیمی انتهاهای صاف ایجاد کنند، مانند Sma I و دیگران. T4 DNA لیگاز می تواند مستقیماً یک پیوند فسفودی استری بین ناقل و درج ایجاد کند و نیازی به جفت شدن بین بازها نیست. با این حال، این روش دارای راندمان پایین بستن است و مستعد خود بستن وکتور است. به طور کلی، انتهای صاف را می توان به انتهای چسبنده تبدیل کرد و سپس بستن. به عنوان مثال، افزودن پایه های پلی A و پلی T مکمل به انتهای قطعه هدف و انتهای مکمل وکتور و چسبنده مصنوعی به ترتیب کارایی اتصال را توسط ترانسفراز دئوکسی نوکلئوتیدیل ترمینال بهبود می بخشد.

2.1.4 شبیه سازی TA

وکتور T مورد استفاده در شبیه سازی TA دارای یک T-overhang در انتهای 3' است. هنگامی که توالی DNA قطعه هدف نامشخص است، قطعه ژن هدف را می توان با شبیه سازی TA به ناقل T متصل کرد و با تعیین توالی، ژن هدف را تعیین کرد. Taq DNA پلیمراز مورد استفاده در PCR دارای فعالیت ترانسفراز پایانی است و می تواند یک نوکلئوتید "A" را به انتهای 3' قطعه DNA اضافه کند. T4 DNA لیگاز می تواند محصول تقویت شده توسط Taq DNA پلیمراز را مستقیماً به وکتور T متصل کند و محصول تقویت شده PCR می تواند بدون افزودن آداپتورهای مصنوعی به هدف شبیه سازی کارآمد دست یابد.

شکل 3. گردش کار شبیه سازی TA^[2]

2.2 بستن آداپتور NGS

در طول ساخت نسل بعدی کتابخانه توالی یابی، لازم است آداپتور مصنوعی را به محصول PCR قبل از اینکه بتوان آن را روی سلول جریان روی تراشه توالی یابی ثابت کرد و برای تکمیل توالی یابی ثابت کرد، متصل کرد. ساختمان کتابخانه پیوندی پیوند دهنده کلونینگ TA یک وسیله فنی بسیار رایج است و اصل آن مشابه شبیه سازی TA فوق الذکر است. پس از اینکه قطعه DNA برای تعیین توالی در انتهای 5' فسفریله شد و "A" در انتهای 3' اضافه شد، مکمل و با آداپتور با انتهای چسبنده "T" جفت می شود. سپس رشته دوتایی کامل توسط دستگاه تشکیل و توالی یابی می شود.
در طول بستن TA، انواع مختلف نمونه یا پیچیدگی ساختار قطعه اسید نوکلئیک بر کارایی بستن تأثیر می‌گذارد، بنابراین آداپتورهای پلت‌فرم‌های مختلف نیز بر نتیجه نهایی کتابخانه تأثیر خواهند داشت.
به عنوان مثال، آداپتور حباب پلت فرم MGI دارای ساختار ثانویه خاصی است و نیاز به راندمان بسیار بالایی برای لیگاز DNA T4 دارد و کاهش راندمان بستن مستقیماً بر خروجی کتابخانه تأثیر می گذارد.

شکل 4. فرآیند بستن آداپتور عمومی

3.Yeasen Biotech T4 DNA لیگاز را می توان برای بستن آداپتور NGS استفاده کرد

Yeasen Biotech به طور ویژه توسعه یافته است T4 DNA لیگاز سریع برای بستن قطعات و آداپتورهای DNA در فرآیند ساخت کتابخانه NGS. این آنزیم دارای قابلیت بستن کارآمد است، نه تنها سرعت اتصال سریع، بلکه با انواع مختلف نمونه ها نیز سازگار است، که برای اتصال قطعات اسید نوکلئیک با ساختارهای پیچیده سودمندتر است. در حال حاضر، با توالی یابی با توان بالای تعداد زیادی از مشتریان تأیید شده است. برای اتصال آداپتورهای حباب بر روی پلت فرم MGI، کیفیت توالی عالی را نیز می توان به دست آورد.

3.1 Yeasen Biotech Fast T4 DNA لیگاز با راندمان بستن فوق العاده بالا

از Yeasen Biotech Fast T4 DNA لیگاز برای ساخت کتابخانه هایی با انواع آداپتورهای مختلف استفاده کنید. نمونه یک تقلید cfDNA 170 جفت باز است و از کتابخانه Agilent 2100 برای تشخیص نتایج استفاده می شود. ① محصول آداپتور غیر متصل؛ ②محصول آداپتور تک پایانی؛ ③محصول آداپتور دو طرفه؛ ④آداپتور باقی مانده. از نتایج بدست آمده می توان دریافت که راندمان بستن آداپتورهای تک سر و دو سر بسیار بالاست.

شکل 5. انواع مختلف محصولات بستن که توسط Agilent 2100 شناسایی شده اند

3.2 Yeasen Biotech Fast T4 DNA لیگاز با عملکرد کتابخانه ای عالی

با استفاده از Fast T4 DNA Ligase برای انواع مختلف ساخت کتابخانه، در مقایسه با سایر لیگازهای DNA T4، بازده کتابخانه بهتر است.

جدول 1. کتابخانه ها انواع مختلف نمونه ها را تولید می کنند

4. راهنمای انتخاب Yeasen Biotech T4 DNA ligase

Yeasen یک شرکت بیوتکنولوژی است که در تحقیق، توسعه، تولید و فروش سه معرف اصلی بیولوژیکی فعالیت می کند: مولکول ها، پروتئین ها و سلول ها. علاوه بر Fast T4 DNA لیگاز، Yeasen Biotech نیز دارد T4 DNA لیگاز جدید و سریع T4 DNA لیگاز برای انتخاب می توانید آنها را بر اساس برنامه های نمایش داده شده در جدول زیر انتخاب کنید:

جدول 2: محصولات مرتبط

مراجع

[1] W. یوان. مهندسی ژن[M]. مطبوعات صنایع شیمیایی، 2019.
[2] Clark DP، Pazdernik NJ، Mcgehee M R. Cloning Genes for Synthetic Biology - ScienceDirect[J]. زیست شناسی مولکولی (نسخه سوم)، 2019: 199-239.
[3] Tomkinson AE, Vijayakumar S, Pascal JM, et al. لیگازهای DNA: ساختار، مکانیسم واکنش و عملکرد [J]. بررسی های شیمیایی، 2006، 106 (2): 687-699.
[4] Shuman S. DNA لیگازها: پیشرفت و چشم انداز [J]. مجله شیمی بیولوژیکی، 2009، 284 (26): 17365-17369.