شکل 1. نمودار شماتیک dsDNA برش DNase I در حضور Mg²⁺ و منگنز²⁺

DNase I معمولی عمدتاً از پانکراس گاو خالص می شود یا یک آنزیم نوترکیب است. در مقایسه با DNase I خالص‌شده از پانکراس گاو، DNase نوترکیب I دارای سطوح RNase درون‌زا نسبتاً پایین‌تری است یا می‌تواند به عنوان محصولات بدون RNase فرموله شود، که آن را برای کاربردهای حساس به RNase، مانند حذف DNA از نمونه‌های RNA، مناسب‌تر می‌کند.

برنامه های کاربردی

با توجه به کاربردها، DNase I به دلیل استفاده از آن در آزمایشات مربوط به حفظ یکپارچگی RNA، مانند استخراج RNA عاری از DNA، تهیه الگوهای RNA بدون gDNA قبل از رونویسی معکوس، و تخریب الگوهای DNA پس از رونویسی در شرایط آزمایشگاهی، مشهور است. علاوه بر این، می‌توان از آن برای هضم پروب‌های DNA در حذف rRNA، برای برچسب‌گذاری DNA از طریق ترجمه نیک، آنالیز برهمکنش‌های DNA-پروتئین با استفاده از روش ردیابی، تولید کتابخانه‌های تصادفی DNA، کاهش ویسکوزیته لیزات سلولی یا عصاره‌های پروتئینی، هضم چسبندگی‌های سلولی به‌عنوان یک کنترل ژنتیکی مثبت و تا حدی در کشت DNA سلولی T. سنجش برای تشخیص آپوپتوز به طور خلاصه، DNase I را می توان تقریباً در هر برنامه ای که به هضم آنزیمی DNA نیاز دارد استفاده کرد. در زیر، معرفی مختصری از چندین برنامه کاربردی رایج ارائه خواهد شد.

• حذف gDNA قبل از استخراج RNA یا رونویسی معکوس

RNA به عنوان نمونه ای که معمولاً در آزمایشگاه ها مورد مطالعه قرار می گیرد، به دلیل کیفیت خاص خود، کیفیت داده های تجربی را به شدت تحت تأثیر قرار می دهد. به طور کلی اجتناب از باقیمانده gDNA در طول فرآیند استخراج RNA غیرممکن است. بنابراین، قبل از انجام برنامه های چالش برانگیز پایین دست (مانند تجزیه و تحلیل بیان mRNA، تجزیه و تحلیل رونوشت و غیره)، معمولاً توصیه می شود نمونه های RNA را با DNase I برای هضم gDNA باقیمانده درمان کنید. هضم gDNA می تواند در طول استخراج RNA، پس از استخراج RNA یا قبل از رونویسی معکوس RNA انجام شود.

شکل 2. فرآیند حذف gDNA مبتنی بر DNase I

• حذف DNA الگو در رونویسی آزمایشگاهی

رونویسی آزمایشگاهی (IVT) در درجه اول از DNA به عنوان یک الگو برای تولید RNA تحت تأثیر سوبستراها و بافرهای مناسب استفاده می کند. RNA پلیمرازهای رایج مورد استفاده در این فرآیند شامل T7، T3 و SP6 هستند که وظیفه کاتالیزور سنتز RNA را بر عهده دارند. با این حال، محصول RNA سنتز شده ممکن است حاوی بقایای DNA باشد و از بین بردن این باقیمانده‌ها برای آزمایش‌های پایین دستی مفید است.

به خصوص در فرآیند توسعه واکسن‌های mRNA، حذف این بقایای DNA یک مرحله حیاتی است که مستقیماً بر دشواری فرآیندهای تصفیه بعدی و خلوص محصول نهایی تأثیر می‌گذارد.برای از بین بردن موثر DNA الگو، DNase I معمولاً برای درمان استفاده می شود تا اطمینان حاصل شود که نمونه RNA عاری از بقایای DNA است، مرحله ای که به بهبود دقت و کارایی کلی آزمایش کمک می کند.

شکل 3: فرآیند رونویسی in vitro با استفاده از پلاسمید خطی شده به عنوان الگو^[4]

• حذف rRNA در ساخت و توالی یابی کتابخانه RNA

در موجودات، rRNA بسیار فراوان و بسیار حفاظت شده است، که برای به دست آوردن تحقیقات اطلاعات بیولوژیکی اهمیت کمی دارد. با این حال، 95 درصد از کل RNA استخراج شده در طول آزمایش ها rRNA انسانی است و وجود این rRNA ها ممکن است در تشخیص RNA های هدف اختلال ایجاد کند. بنابراین، در تهیه و تعیین توالی کتابخانه RNA، rRNA معمولاً ابتدا حذف می شود. در حال حاضر، روش اصلی برای حذف rRNA، هضم RNAase است و عملیاتی اصلی آن است مراحل و اصول به شرح زیر است:

1. استخراج RNA کل.
2. هیبریداسیون پروب های DNA تک رشته ای با مولکول های rRNA (توجه: طراحی و سنتز پروب های DNA تک رشته ای اختصاصی rRNA).
3. RNase H rRNA هیبرید شده را تخریب می کند.
4. DNase I کاوشگرهای DNA را تخریب می کند.
5. rRNA با موفقیت حذف شد و الگوهای RNA غیر rRNA را پشت سر گذاشت.

شکل 4: نمودار شماتیک اصل حذف rRNA بر اساس روش آنزیمی^[5]

• ترجمه نیک برای برچسب گذاری DNA

ترجمه نیک متداول ترین روش مورد استفاده برای برچسب زدن پروب های اسید دئوکسی ریبونوکلئیک در آزمایشگاه است. این روش از طریق عمل ترکیبی DNase I و E.coli DNA پلیمراز I.

اصل اصلی به شرح زیر است:

1. ابتدا از غلظت مناسبی از DNase I برای ایجاد چندین شیار تک رشته ای در هر رشته از DNA دو رشته ای که قرار است برچسب گذاری شود، استفاده کنید و انتهای هیدروکسیل 3' را در محل های نیک تشکیل دهید.
2. سپس، از فعالیت اگزونوکلئاز 5'→3' استفاده کنید coliDNA پلیمراز I برای حذف یک نوکلئوتید از انتهای 5 'نیک، در حالی که فعالیت پلیمراز 5'→3' E. coli DNA پلیمراز I یک نوکلئوتید نشاندار شده را به انتهای 3 'نیک وارد می کند تا آن را ترمیم کند. با حرکت شیار در امتداد رشته DNA، نوکلئوتیدهای نشاندار شده در رشته DNA تازه سنتز شده ترکیب می شوند.

شکل 5: نمودار شماتیک اصل برچسب گذاری DNA با ترجمه نیک^[6]

• آزمایش سنجش ردپای DNase I

سنجش ردپای DNase I یک روش دقیق برای شناسایی محل‌های اتصال پروتئین‌های متصل به DNA بر روی مولکول‌های DNA است. اصل این است که پروتئین های متصل به یک قطعه DNA، ناحیه متصل شده را از تخریب توسط DNase I محافظت می کنند. پس از هضم آنزیمی، قطعه باقی مانده ("ردپای") می تواند برای تعیین توالی آن استفاده شود. در تصویر ژل، هیچ نوار مربوط به مناطقی که پروتئین در آن متصل است وجود ندارد.

اصل اصلی به شرح زیر است:

1. انتهای تک رشته ای مولکول DNA دو رشته ای را که باید آزمایش شود، برچسب بزنید.
2. پروتئین را با DNA مخلوط کنید و مقدار مناسبی از DNase I را برای هضم آنزیمی اضافه کنید و قطعات DNA با طول های مختلف را تشکیل دهید.مقدار آنزیم باید کنترل شود تا اطمینان حاصل شود که قطعات DNA مجاور تنها با یک نوکلئوتید متفاوت هستند و کنترل بدون پروتئین افزوده باید به صورت موازی گنجانده شود.
3. پروتئین را از DNA جدا کنید، DNA دناتوره شده را با الکتروفورز PAGE جدا کنید و برای تفسیر توالی نوکلئوتیدی ناحیه ردپا در مقایسه با گروه کنترل، اتورادیوگراف را انجام دهید.

شکل 6: نمودار شماتیک اصل سنجش ردپای DNase I^[7]

را DNase I راهنمای انتخاب Yeasen

Yeasen برای برآوردن نیازهای مختلف برنامه های کاربردی ارائه می دهد نوترکیب DNase I در E. coliو می تواند DNase I با درجه GMP را برای برآوردن نیازهای mRNA رونویسی در شرایط آزمایشگاهی و سایر کاربردها فراهم کند.

موقعیت یابی محصول	برنامه	نام محصول	شماره کاتالوگ
RNase رایگان	حذف DNA از RNA و آماده سازی پروتئین	DNase نوترکیب I (بدون RNase)	10325ES
درجه GMP، RNase رایگان	رونویسی in vitro mRNA	UCF.ME® دئوکسی ریبونوکلئاز I (DNase I) درجه GMP	10611ES

مراجع

[1] Ndiaye C، Mena M، Alemany L، و همکاران. تشخیص HPV DNA، E6/E7 mRNA و p16INK4a در سرطان های سر و گردن: یک بررسی سیستماتیک و متاآنالیز [J]. The Lancet Oncology، 2014، 15(12): 1319-1331.

[2] بروکلی F، Fusetti L، Rosini S، و همکاران. مقایسه بار DNA ویروسی نوع خاص HPV انکوژن و تشخیص mRNA ژن E6/E7 در نمونه های دهانه رحم: نتایج یک مطالعه چند مرکزی [J]. مجله ویروس شناسی پزشکی، 1392، 85(3): 472-482.

[3] Huang Z، Fasco MJ، Kaminsky L S. بهینه سازی حذف Dnase I DNA آلوده از RNA برای استفاده در RNA-PCR کمی [J]. بیوتکنیک، 1996، 20(6): 1012-1020.

[4] Kang DD، Li H، Dong Y. پیشرفت‌های mRNA رونویسی شده در شرایط آزمایشگاهی (IVT mRNA) برای فعال کردن ترجمه به کلینیک‌ها [J]. بررسی های پیشرفته تحویل دارو، 2023، 199: 114961.

[5] Wiame I، Remy S، Swennen R، و همکاران. غیرفعال سازی حرارتی برگشت ناپذیر DNase I بدون تخریب RNA [J]. بیوتکنیک، 2000، 29(2): 252-256.

[6] Adolph S، Hameister H. ترجمه درجا کروموزومهای متافاز با d-UTP[J] نشاندار شده با بیوتین. ژنتیک انسانی، 1985، 69: 117-121.

[7] آهنگ C، Zhang S، Huang H. انتخاب یک روش مناسب برای شناسایی منشاء همانندسازی در ژنوم های میکروبی. Front Microbiol، 2015، 6: 1049.