RNase HII، همچنین به عنوان RNase H2 شناخته می شود، یک اندوریبونوکلئاز است که به طور خاص پیوند فسفودی استر را در انتهای 5 یک ریبونوکلئوتید منفرد که درون یک مارپیچ DNA دو رشته ای قرار دارد، هدف قرار داده و قطع می کند و یک فسفات 5' و یک گروه هیدروکسیل 3' ایجاد می کند (شکل). این آنزیم حداقل فعالیت برش را نسبت به RNA تک رشته ای نشان می دهد و در برابر DNA دو رشته ای (dsDNA) و DNA تک رشته ای (ssDNA) غیر فعال است. از لحاظ عملکردی در محدوده دمایی 50 تا 75 درجه سانتی گراد، RNase HII در دماهای بین 70 تا 75 درجه سانتی گراد به اوج عملکرد می رسد. RNase HII با استفاده از توانایی منحصر به فرد خود برای انجام برش هدفمند و تک سایتی در مکان های DNA که در آن یک ریبونوکلئوتید یکپارچه شده است، بدون تأثیر بر dsDNA یا ssDNA، به عنوان یک "محرک" دقیق برای شروع واکنش، از جمله فعال سازی و گسترش پرایمر، برای دستیابی به تقویت خاص عمل می کند. این آنزیم نقش محوری در PCR وابسته به RNase H (rhPCR)، فناوری تقویت همدما با واسطه حلقه (LAMP) و تخریب اجزای RNA در قطعات اوکازاکی ایفا می کند.

一. PCR وابسته به RNase H(rhPCR)
rhPCR دارای RNase HII و پرایمرهای rhPCR قابل جدا شدن با طراحی خاص و بسته در فرآیند PCR است. این رویکرد از ویژگی منحصر به فرد RNase HII برای هیدرولیز انتخابی RNA در هیبریدهای DNA-RNA استفاده می کند، در حالی که پیوندهای فسفودی استر را در DNA و RNA تک رشته ای یا دو رشته ای دست نخورده باقی می گذارد. در نتیجه، RNase HII تنها هیبرید DNA-RNA را هضم می کند و زمانی که پرایمر کاملا مکمل توالی DNA هدف باشد اجازه گسترش پرایمر را می دهد. این اقدام هدفمند به طور قابل توجهی دقت واکنش را افزایش می دهد. RNase HII تنها آنزیمی است که قادر است حذف دقیق ریبونوکلئوتیدها را بدون ایجاد جهش با شکاف در انتهای 5' اسید ریبونوکلئیک آغاز کند. با توجه به ویژگی، حساسیت و تکرارپذیری بالا، rhPCR مزایای متمایزی در کاربردهایی مانند تشخیص پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNP)، تایپ ژن، تشخیص همزمان چندین هدف و تجزیه و تحلیل اسید نوکلئیک محیطی ارائه می‌کند.

مسیر فنی

1. طراحی پرایمر

طراحی پرایمر باید اطمینان حاصل کند که دمای ذوب پس از برش بالاتر از دمای بازپخت است تا اطمینان حاصل شود که پرایمر به طور پایدار به قالب در طول چرخه‌های PCR متصل می‌شود. پرایمر rhPCR از سه قسمت تشکیل شده است:

1）5' قطعه DNA: از نظر طول و دمای ذوب (Tm) مورد نیاز با پرایمرهای استاندارد PCR قابل مقایسه است، می تواند به طور موثر با DNA الگو پس از برش توسط آنزیم RNase HII جفت شود و از آن خارج شود.

2) یک پایه RNA منفرد: ایجاد یک محل برش برای RNase HII.

3）3' بخش DNA: طول چهار یا پنج باز با یک مسدود کننده، معمولاً یک مولکول کوتاه و غیر قابل گسترش مانند پروپیلن گلیکول، که از گسترش DNA پلیمراز تا حذف مسدود کننده جلوگیری می کند.

2. برش و گسترش

در شروع واکنش rhPCR، پرایمر و DNA الگو آزاد هستند. هنگامی که پرایمر به الگوی هترودپلکس RNA:DNA خاص متصل می شود، سمت پایه RNA 5' پرایمر مسدود شده توسط آنزیم RNase HII برش داده می شود و یک الیگونوکلئوتید DNA با گروه 3'-هیدروکسیل باقی می ماند و نقطه شروعی برای گسترش DNA پلیمراز فراهم می کند. این توسط فرآیند معمولی تقویت PCR دنبال می شود.

شکل 2. نمودار اصل rhPCR ^[1]

二تقویت همدما با واسطه حلقه (LAMP)

تقویت همدما با واسطه حلقه (LAMP) یک روش ساده و سریع برای تقویت ژن است که می تواند اسیدهای نوکلئیک را در شرایط همدما در مدت زمان کوتاهی تقویت کند. با این حال، به دلیل شروع فعالیت DNA پلیمراز در طول آماده سازی در دمای اتاق، ناهماهنگی های غیر اختصاصی ایجاد می شود که می تواند منجر به مقدار کمی از جفت گیری نادرست و دایمرهای پرایمر شود و باعث آلودگی های جزئی شود که ممکن است منجر به مثبت کاذب شود.
استفاده از RNase HII در سیستم تقویت LAMP می تواند به طور موثری مسئله مثبت کاذب در فناوری LAMP را برطرف کند و کاربرد آن را در تشخیص بالینی گسترش دهد. همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است، روش LAMP فعال شده با پرایمر (PA-LAMP) با استفاده از RNase HII، زمانی که پرایمر با ssDNA هدف جفت می شود، آنزیم RNase HII به طور خاص RNA روی پرایمر را می شکافد، آن را فعال می کند و اجازه گسترش پرایمر، دستیابی به تقویت خاص و کاهش موثر در سیستم را می دهد.

YEASEN RNase HII

RNase HII YEASEN (Cat#14539) مشتق شده از Pyrococcus Abyssi، Paو عاری از نوکلئازهای آلوده کننده، آنزیم های nicking و باقیمانده های RNase، با آلودگی کم DNA میزبان، به طور موثری موارد مثبت کاذب را در سیستم کاهش می دهد. RNase HII YEASEN بسیار مقاوم در برابر حرارت است و فعالیت خود را حتی پس از 30 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد حفظ می کند و آن را با سیستم های مختلف واکنش rhPCR سازگار می کند و همچنین برای LAMP و سایر کاربردها مناسب است.

1. E. coli باقیمانده DNA ژنومی <0.5 کپی/100 U

تشخیص E. coli باقیمانده DNA ژنومی در دسته های مختلف RNase HII نشان داد که باقی مانده DNA ژنومی میزبان RNase HII YEASEN بسیار کمتر از 0.5 کپی در 100 U است.

شکل 4. تشخیص E. coli باقیمانده DNA ژنومی

2. تست مقاومت حرارتی 95 درجه سانتی گراد

پس از حرارت دادن RNase HII در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 0 تا 45 دقیقه، فعالیت آنزیمی RNase HII مورد آزمایش قرار گرفت. نتایج نشان داد که تقریباً هیچ از دست دادن فعالیت آنزیمی در RNase HII YEASEN حتی پس از 45 دقیقه حرارت دادن وجود ندارد.

شکل 5. تست مقاومت حرارتی 95 درجه سانتی گراد

3. بدون اگزونوکلئاز، آنزیم نیکون یا RNase باقی مانده (1 U Dose)

انکوباسیون 1 U از دسته‌های مختلف RNase HII با سوبستراهای مربوطه به DNA/RNA در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 4 ساعت، نتایج الکتروفورز ژل آگارز نشان داد که هیچ اگزونوکلئاز، آنزیم نیک‌کننده یا RNase در RNase HII وجود ندارد.

شکل 6.نتایج تشخیص اگزونوکلئاز، آنزیم نیکینگ و باقیمانده RNase

محصولات مرتبط توصیه شده

برنامه کاربردی محصول	نام محصول	شماره کاتالوگ
rhPCR، لامپ	RNase HII (2 U/μL) RNase HII، بدون گلیسرول (2 U/μL)	14539ES 14541ES
rhPCR	Hieff® Taq DNA Polymerase	10101ES
RT-LAMP	Hieff® Bst Plus DNA Polymerase (40 U/μL)	14402ES
	Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase	11111ES

مراجع

[1] Dobosy JR، Rose SD، Beltz KR، Rupp SM، ​​Powers KM، Behlke MA، Walder JA. PCR وابسته به RNase H (rhPCR): ویژگی بهبود یافته و تشخیص پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی با استفاده از پرایمرهای قابل شکافت مسدود شده. BMC بیوتکنول. 10 اوت 2011؛ ​​11:80. doi: 10.1186/1472-6750-11-80.

[2] Du WF، Ge JH، Li JJ، و همکاران. تشخیص تک مرحله‌ای و با ویژگی بالا جهش تک نوکلئوتیدی با تقویت همدما با واسطه حلقه قابل فعال‌سازی با آغازگر (PA-LAMP) [J]. Analytica chimica acta، 2019(1050-):1050.DOI:10.1016/j.aca.2018.10.068.