1. چگونه از تجزیه RNA جلوگیری کنیم؟

2. مهارکننده های RNase چیست؟

3. مهارکننده RNase چه کاری انجام می دهد؟

4. یک مهارکننده RNase موشی چه ویژگی هایی دارد؟

5. محصولات مرتبط و عملکرد

6. محصولات مرتبط

7. سوالات متداول

1. چگونه از تجزیه RNA جلوگیری کنیم؟

RNase نقش مهمی در متابولیسم اسید نوکلئیک دارد و تقریباً در هر نوع پروکاریوت و یوکاریوت یافت می شود. RNase در مایعات بدن مانند اشک، بزاق و عرق برای دفاع در برابر تهاجم میکروارگانیسم ها ترشح می شود و RNase نیز در باقی مانده های پوستی وجود دارد. با این حال، منبع اصلی RNase در بیشتر محیط‌ها میکروارگانیسم‌ها، یعنی باکتری‌ها و قارچ‌ها هستند. غیرفعال کردن RNase بسیار سخت است و پایداری بالا، مقاومت در برابر حرارت، مقاومت اسیدی و مقاومت قلیایی را نشان می دهد. پس از دناتوره شدن حرارتی، می تواند به سرعت ساختار اولیه خود را به دست آورد. RNase معمولاً بسیار فعال است و به طور گسترده در سلول ها و بافت های یوکاریوتی و پروکاریوتی توزیع می شود. RNA موجود در نمونه می تواند به طور کامل با مقدار کمی آلودگی RNase تجزیه شود. آلودگی RNase در مطالعات می تواند از منابع داخلی و خارجی باشد. RNase در سلول ها در درجه اول یک منبع درون زا آلودگی است، در حالی که منابع برون زا شامل منابع تجربی، محیط آزمایشگاه و خود آزمایش کنندگان است. RNase ها، به ویژه اعضای خانواده RNase A، پروتئین های کوچک و فشرده ای هستند که حاوی مقدار کمی باقیمانده سیستئین هستند که قادر به ایجاد پیوندهای دی سولفید درون مولکولی هستند. پس از بازگشت به دمای اتاق، در غیاب عامل دناتوره کننده، RNase دناتوره شده ساختار طبیعی و برخی عملکردهای خود را بازیابی می کند. بنابراین، RNase ها پس از چرخه های مکرر انجماد و ذوب، حتی پس از اتوکلاو، فعالیت قابل توجهی را حفظ می کنند. ماهیت پایدار این آنزیم ها آنها را در برابر بسیاری از روش های ضد عفونی مقاوم می کند، که معمولاً به روش های شیمیایی تهاجمی برای از بین بردن RNase ها از سطوح و محلول ها نیاز دارند.

برای جلوگیری از تخریب RNA آسیب پذیر، هنگام کار با RNA باید اقدامات احتیاطی ویژه انجام شود. برای کنترل RNase اگزوژن، اپراتور باید در طول آزمایش دستکش بپوشد و پس از لمس پوست، دستگیره درها و سطح اشیاء معمولی دستکش را عوض کند. و اپراتور باید از یک پیپت تفنگ مخصوص برای عملیات RNA استفاده کند و از نوک دیواره‌های بدون RNase، لوله‌های سانتریفیوژ، ترکیبات و معرف‌ها استفاده کند. از سوراخ‌های تهویه و پنجره‌های باز دور نگه دارید یا آن را بپوشانید و از مناطقی که کمتر مسافرت می‌کنید به‌عنوان مناطق عاری از RNase استفاده کنید. و در طول استخراج و تجزیه و تحلیل RNA، آزمایش های دیگری که ممکن است باعث آلودگی RNase شود، انجام ندهید.
روش مهار فعالیت RNase درون زا ابتدا حفظ نمونه است. پس از نمونه برداری از بافت، RNA نباید مستقیما استخراج شود. در عوض، باید به سرعت منجمد شود و در یک محیط -80 درجه سانتیگراد با نیتروژن مایع به موقع نگهداری شود و آزمایش باید در اسرع وقت انجام شود تا تخریب RNA به حداقل برسد.مهارکننده‌های RNase به لیزات سلولی اضافه می‌شوند تا به طور همزمان سلول‌ها را بشکنند و RNase را غیرفعال کنند و فعالیت RNase آزاد شده در طول شکستن سلول را به حداقل برسانند. تمام معرف ها و تجهیزات باید قبل از استفاده برای غیرفعال کردن RNase ها به طور ویژه درمان شوند.

علاوه بر این، بازدارنده های RNA را می توان برای مهار فعالیت RNase و جلوگیری از تخریب RNase RNA استفاده کرد. انواع مختلفی از مهارکننده های RNA وجود دارد:

• دی اتیل پیروکربنات (DEPC): این یک مهارکننده قوی اما نه کامل RNase است. این پروتئین را از طریق ترکیب حلقه ایمیدازول هیستیدین در گروه ژن فعال RNase دناتوره می کند و در نتیجه فعالیت آنزیم را مهار می کند.
• گوانیدین ایزوتیوسیانات: در حال حاضر به عنوان موثرترین مهارکننده RNase در نظر گرفته می‌شود، همچنین می‌تواند RNase را در حین لیز کردن بافت غیرفعال کند، که می‌تواند ساختار سلولی را از بین ببرد و اسید نوکلئیک را از نوکلئوپروتئین جدا کند و همچنین تأثیر خاصی بر اثر دناتوره‌کننده قوی RNase دارد.
• کمپلکس وانادیل ریبونوکلئوزید: کمپلکسی است که توسط یون‌های اکسید وانادیم و نوکلئوزیدها تشکیل می‌شود که می‌تواند با RNase ترکیب شود تا یک آنالوگ انتقالی ایجاد کند و تقریباً به طور کامل فعالیت RNase را مهار کند.
• مهارکننده پروتئین RNase (RNasin): یک گلیکوپروتئین اسیدی استخراج شده از کبد موش صحرایی یا بلاستودیسک انسان، RNasin یک مهارکننده غیررقابتی RNase است که می تواند به انواع RNase متصل شود و آن را غیرفعال کند.
• سایرین: SDS، اوره، خاک دیاتومه و غیره نیز اثر مهاری خاصی روی RNase دارند.

2. مهارکننده های RNase چیست؟

مهارکننده های RNase دسته ای از مواد هستند که می توانند فعالیت RNase را مهار کنند. مهارکننده‌های رایج RNase شامل دی‌اتیل پیروکربنات (DEPC)، گوانیدین ایزوتیوسیانات، مجتمع‌های ریبونوکلئوزید وانادیل (RVC) و مهارکننده‌های پروتئینی RNase (RNasin) هستند. در میان آنها، DEPC و گوانیدین ایزوتیوسیانات دارای سمیت خاصی هستند و RVC دارای اثر مهاری بر روی پلیمراز PCR است که برای آزمایش‌های بعدی مساعد نیست. RNasin سمی نیست و یک مهار کننده غیر رقابتی RNase است که می تواند به RNase های مختلف متصل شود تا آنها را غیرفعال کند.

3. مهارکننده RNase چه کاری انجام می دهد؟

مهارکننده‌های RNase معمولاً به عنوان یک اقدام احتیاطی در دستکاری‌های آنزیمی RNA برای مهار و کنترل چنین آلاینده‌هایی استفاده می‌شوند. RNasin یک گلیکوپروتئین اسیدی است که از کبد موش صحرایی یا بلاستودرم انسان استخراج می شود که می تواند به طور خاص به RNase به صورت غیر کووالانسی برای تشکیل یک کمپلکس متصل شود و باعث غیرفعال شدن RNase شود و در نتیجه از یکپارچگی RNA محافظت کند. در حال حاضر، مهارکننده RNase به جلوگیری از تخریب RNA در کاربردهایی مانند سنتز cDNA، RT-PCR، واکنش‌های رونویسی/ترجمه در شرایط آزمایشگاهی یا خالص‌سازی RNA کمک می‌کند.

4. یک مهارکننده RNase موشی چه ویژگی هایی دارد؟

مهارکننده‌های موش نوترکیب RNase حاوی 2 سیستئین حساس به اکسیداسیون نیستند که در مهارکننده‌های RNase منشأ انسانی وجود دارند. بنابراین، مهارکننده RNase موش دارای فعالیت ضد اکسیداسیون بالایی است و برای آزمایش‌های DTT پایین پایدارتر است. علاوه بر این، Murine RNase Inhibitor Yeasen دارای ویژگی های زیر است:
1) مهار همه جانبه RNase: مهارکننده RNase موشی YEASEN به طور خاص RNase A، RNase B، RNase C و غیره را مهار می کند.
2) شرایط واکنش همه کاره: بازدارنده RNase در pH 5.0-9.0 و 25 ℃-55 ℃ فعال است که برای ترانس کریپتاز معکوس مقاوم در برابر حرارت مناسب است.
3) چندین آزمایش پایین دستی امکان پذیر است: هنگامی که مهارکننده RNase با Taq DNA پلیمراز، AMV یا M-MuLV Reverse Transcriptase یا فاژ RNA پلیمراز (SP6، T7، یا T3) استفاده می شود، هیچ مهاری از فعالیت پلیمراز مشاهده نمی شود.
4) کالاهای تولید انبوه: یک ظرفیت تولید واحد 2 میلیارد U برای مدیریت هزینه با اطمینان از همگن بودن محصول، ثبات عرضه و به موقع بودن مفید است.
5) سازگاری دسته به دسته: بیان پروتئین بالغ و پلت فرم تصفیه توسط سیستم مدیریت کیفیت ISO13485، آزمایش کنترل کیفیت توسط الزامات کیفیت برای اطمینان از ثبات محصول بین دسته ها.

5. محصولات مرتبط و عملکرد

A. مهارکننده RNase فعالیت RNase را مسدود می کند

1μg RNA کل سلول HEK، 1μL بازدارنده RNase می تواند به طور موثر 5ng RNase را مهار کند.

شکل 1. اثر مهاری مهارکننده RNase موشی.

B. RNase Inhibitor از محصولات خارجی در آزمایش qPCR پیشی می گیرد

تاثیر مهاری مهارکننده‌های RNase مشتق از موش Yeasen و R* (MRI) با استفاده از تکنیک qPCR در شرایط تجربی یکسان اندازه‌گیری شد، و مهارکننده RNase منبع موشی YEASEN به طور موثر RNase A را در سیستم مهار کرد. تأثیر بازداری نسبت به رقبا برتر بود.

شکل 2. تست مهار RNase R* MRI

نکته: منحنی های شکل از چپ به راست عبارتند از: کنترل مثبت (فقط RNA، بدون RNase و MRI)، MRI 40 U، 30 U MRI، 20 U MRI، 10 U MRI، و کنترل منفی (RNA + RNase، بدون MRI).

شکل 3. تست بازداری RNase MRI Yeasen

توجه: منحنی های شکل از چپ به راست عبارتند از: کنترل مثبت (فقط RNA، بدون RNase و MRI)، 80 U MRI، 60 U MRI، 40 U MRI، 30 U MRI، 20 U MRI، 10 U MRI، کنترل منفی (RNA+RNase، بدون MRI).

شکل 4. نتایج CT RT-qPCR از Yeasen MRI و R* MRI

6. محصولات مرتبط

محصولات مرتبطی که Yeasen می تواند ارائه دهد در جدول 1 نشان داده شده است:

جدول 1.لیست محصولات

7. سوالات متداول

Q1: آیا RNase در مهارکننده RNase موشی وجود خواهد داشت؟
پاسخ: هر معرف فعالیت RNase را تشخیص می دهد تا اطمینان حاصل شود که مهارکننده RNase موشی آلودگی RNase را به همراه نمی آورد.
Q2: آیا مهارکننده‌های RNase موشی تأثیری بر آزمایش‌های PCR پایین‌دستی خواهند داشت؟
ج: تأثیری نخواهد داشت. هر دسته از مهارکننده RNase موش پس از آزمایش کیفیت از آلودگی ژنومی پاک می شود و ممکن است در تحقیقات RT-PCR و RT-qPCR استفاده شود.
Q3: آیا مهارکننده RNase موشی غیرفعال می شود؟
پاسخ: بازدارنده ها در دمای بالاتر از 65 درجه سانتیگراد غیرفعال می شوند و هم زدن شدید نیز باعث غیرفعال شدن می شود.
Q4: هنگام استفاده از مهارکننده RNase موشی برای آماده سازی سیستم واکنش چه اقدامات احتیاطی باید انجام شود؟
پاسخ: هنگام آماده سازی سیستم، می توان ابتدا یک مهارکننده RNase قبل از افزودن سایر اجزایی که ممکن است منابع آلودگی RNase را معرفی کنند، اضافه کرد.
Q5: آیا مهارکننده RNase موشی فعالیت اندونوکلئاز و اگزونوکلئاز دارد؟
پاسخ: هیچ فعالیت اندونوکلئاز و اگزونوکلئاز وجود ندارد که به بهبود بازده محصول کمک می کند.

در مورد خواندن:

مهارکننده‌های RNase موشی - آلودگی RNase را با موفقیت از بین می‌برند و RNA را حفظ می‌کنند.

انتخاب رونوشت معکوس

YEASEN UDG حساس به گرما——آلودگی آئروسل را به راحتی کنترل کنید

مواد اولیه تقویت همدما با کیفیت بالا - RT-LAMP را حساس تر و سریع تر می کند!