با توسعه سریع گلیکوپروتئومیکس و تحقیقات دارویی آنتی بادی، اصلاح گلیکوزیلاسیون نیز توجه زیادی را به خود جلب کرده است. تماس بین سلول ها و سلول ها و بین سلول ها و پاتوژن ها عمدتاً از طریق تعامل قندها و پروتئین ها تکمیل می شود و گلیکوزیلاسیون ویژگی های چسبندگی گلیکوکونژوگیت ها را تعیین می کند. در IgG، گلیکوزیلاسیون مرتبط با N در Asn297 در ناحیه Fc نیز برای فعالیت آن بسیار مهم است. علاوه بر این، برخی از آنتی‌بادی‌ها N-گلیکان‌های اضافی نیز دارند که همراه با محل حفظ شده در Asn297 در ناحیه Fc، بر تشخیص، نیمه عمر و پاسخ ایمنی آنتی‌بادی تأثیر می‌گذارند.
گلیکوزیلاسیون پروتئین یک اصلاح پیچیده پس از ترجمه است که شامل اتصال زنجیره های گلیکان در مکان های خاص روی پروتئین ها می شود. بسته به نوع زنجیره گلیکان، گلیکوپروتئین ها به گلیکوپروتئین های متصل به N، گلیکوپروتئین های مرتبط با O و غیره تقسیم می شوند. علاوه بر این، گلیکوزیلاسیون پروتئین نیز تحت تأثیر نوع سلول میزبان و شرایط تخمیر (مانند محیط کشت، مقدار pH، دما و غیره) قرار می گیرد. بنابراین، گلیکوپروتئین‌ها معمولاً در الگوهای گلیکوزیلاسیون، از جمله مکان‌های گلیکوزیلاسیون، سطوح گلیکوزیلاسیون و ساختار خاص زنجیره‌های گلیکان، ناهمگنی دارند، که باعث می‌شود تجزیه و تحلیل زنجیره گلیکان و خصوصیات ساختاری بسیار چالش برانگیز باشد. برای به دست آوردن حداکثر مقدار اطلاعات ساختاری زنجیره گلیکان، استراتژی اصلی تجزیه و تحلیل زنجیره گلیکان این است که ابتدا زنجیره های گلیکان را از پروتئین ها آزاد کرده و سپس تجزیه و تحلیل و خصوصیات دقیق را انجام دهیم. در این استراتژی، یک روش گلیکوزیلاسیون کارآمد، دقیق و پایدار بسیار مهم است.
روش های آنزیمی در حال حاضر به طور گسترده برای دی گلیکوزیلاسیون استفاده می شود.
گلیکوپروتئین ها را می توان به گلیکوپپتیدهای N-link و O-linked بر اساس نوع زنجیره گلیکان طبقه بندی کرد. برای گلیکوپپتیدهای مرتبط با N، آنزیم های رایج مورد استفاده شامل پپتید N-گلیکوزیداز F (PNGase F)، اندوگلیکوزیداز H (Endo H) و اندوگلیکوزیداز S (Endo S) هستند. PNGase F پیوند GlcNAc-Asn را هیدرولیز می کند و می تواند زنجیره های گلیکان مانوز بالا، پیچیده و هیبرید را حذف کند. Endo H پیوندهای گلیکوزیدی را در هسته پنتاساکارید زنجیره N-گلیکان می شکافد. Endo S به طور خاص گلیکان های متصل به N را از هسته کیتوبیوز زنجیره سنگین IgG بومی جدا می کند.
شکل 1. محل برش PNGase F، Endo H و Endo S.
در میان آنها، PNGase F موثرترین روش آنزیمی برای از بین بردن تقریباً تمام N-linked است الیگوساکاریدهای موجود در گلیکوپروتئین ها، که می توانند گلیکوپروتئین های الیگوساکاریدی با مانوز بالا، هیبرید و پیچیده را که توسط آسپاراژین متصل شده اند، جدا کنند و به طور خاص گلیکان های مرتبط با N را حذف کنند. محل برش عبارت است از: پیوند آمیدی بین داخلی ترین N-استیل گلوکوزامین (GlcNAc) و باقیمانده آسپاراژین، در حالی که آسپاراژین روی پروتئین پس از هیدرولیز آنزیمی به اسید آسپارتیک تبدیل می شود.
هنگامی که α1-6 فوکوز در هسته GlcNAc قرار دارد، PNGase F نیز می تواند برش دهد. تنها زمانی که α1-3 فوکوز در هسته GlcNAc (که در گلیکوپروتئین های گیاهی و حشرات رایج است) قرار دارد، PNGase F نمی تواند برش دهد.
با این حال، واکنش آنزیمی معمولی PNGase F به چندین ساعت برای آزادسازی آنتی بادی N-گلیکان نیاز دارد و به دلیل ترجیح برای آزادسازی گلیکان، گلیکوزیلاسیون ناقص ممکن است منجر به نتایج مغرضانه شود و توزیع گلیکان به دست آمده ممکن است ترکیب صحیح آنتی بادی های درمانی را نشان ندهد. بنابراین، به دست آوردن یک پروفایل N-گلیکان دقیق در سریع ترین زمان ممکن برای نظارت بر گلیکوزیلاسیون در طول فرآیند تولید آنتی بادی ها و پروتئین های همجوشی آنتی بادی و سایر عوامل بیوتراپی بسیار مهم است.
سریع PNGase F
Fast PNGase F یک معرف نوترکیب بهینه شده است که می تواند به سرعت و به طور کامل آنتی بادی ها، ایمونوگلوبولین ها، پروتئین های همجوشی و سایر گلیکوپروتئین ها را در چند دقیقه دیگلیکوزیله کند. این آنزیم می تواند به سرعت و بدون اولویت تمام N-گلیکان ها را حذف کند و می تواند مستقیماً برای کروماتوگرافی پایین دست یا تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی استفاده شود. Yeasen Fast PNGase F, N-glycosidase F (نسخه سریع) فرآیند آزمایشی را ساده می کند و زمان آزمایش را کاهش می دهد و در عین حال حساسیت و تکرارپذیری را تضمین می کند.
ویژگی های محصول:
سریع: گلیکوزیلاسیون کامل و سریع در چند دقیقه.
خلوص بالا: بدون پروتئاز، آلودگی گلیکوزیداز، خلوص ≥95٪.
غیر انتخابی: به سرعت و بدون اولویت تمام N-گلیکان ها را حذف کنید.
سازگاری خوب: به طور مستقیم برای کروماتوگرافی پایین دست یا تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی استفاده می شود.
داده های تست:
گلیکوزیلاسیون یک مرحله ای پروتئین:
- 10 میکروگرم سوبسترا/100 میکروگرم آنتی بادی و ddH2O مخلوط شده تا حجم کل 16 uL.
- 4 میکرولیتر بافر Fast PNGase F (5x)، حجم نهایی 20 uL اضافه کنید.
- 1 میکرولیتر Fast PNGase F اضافه کنید.
- به مدت 10 دقیقه در دمای 50 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
شکل 2. اثر برش آنزیمی یک مرحله ای روی سوبسترای پروتئین (A) و آنتی بادی (B).
1: Protein MarkerCat#20350ES) 2: رقیب + بستر یا آنتی بادی 3: رقیب + بستر یا آنتی بادی 4: Yeasen Fast PNGase F 5: Yeasen Fast PNGase F6: بستر یا آنتی بادی 7: Yeasen Fast PNGase F 8: رقیب
گلیکوزیلاسیون پروتئین دو مرحله ای:
- 10 میکروگرم سوبسترا/100 میکروگرم آنتی بادی و ddH2O مخلوط شده تا حجم کل 16 uL.
- 4 میکرولیتر بافر Fast PNGase F (5x)، حجم نهایی 20 uL اضافه کنید.
- به مدت 2 دقیقه در دمای 80 درجه سانتیگراد انکوبه شده، تا دمای اتاق خنک شود.
- 1 میکرولیتر Fast PNGase F اضافه کنید.
- به مدت 10 دقیقه در دمای 50 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
شکل 3. اثر برش آنزیمی دو مرحله ای روی سوبسترای پروتئین (A) و آنتی بادی (B).
1: Protein MarkerCat#20350ES) 2: رقیب + بستر یا آنتی بادی 3: رقیب + بستر یا آنتی بادی 4: Yeasen Fast PNGase F 5: Yeasen Fast PNGase F6: بستر یا آنتی بادی 7: Yeasen Fast PNGase F 8: رقیب
نتیجه گیری:
- Yeasen Fast PNGase F دارای راندمان برش آنزیمی یکسان یا بالاتر به عنوان رقبای وارداتی تحت شرایط واکنش مشابه است.
- برای اطمینان از راندمان برش آنزیمی بالاتر، انجام یک برش آنزیمی دو مرحله ای توصیه می شود. برخی از آنتی بادی ها (مانند Fab N-glycosylation) نیاز به یک مرحله پیش گرم کردن دارند
برای گلیکوزیلاسیون موثر
علاوه بر این، Yeasen همچنین PNGase F (Cat#20407ES، فعالیت خاص: 100000 U/mL) و انواع دیگر گلیکوزیدازها، مانند Endo H گلیکوزیداز H (Cat#20414ES)، Endo S گلیکوزیداز S (Cat#20413ES) را ارائه می‌کند.
راهنمای خرید
| تعداد محصول | 20406ES | 20407ES | 20414ES | 20413ES |
| نام محصول | سریع PNGase F | PNGase F | اندو اچ | اندو اس |
| منبع | بیان نوترکیب مخمر | بیان نوترکیب مخمر | بیان نوترکیب مخمر | E.coli بیان نوترکیب |
| فعالیت خاص | قابل اجرا نیست | 100000 واحد در میلی لیتر | 1000000 واحد در میلی لیتر | 8000 U/mg |
| سایت رخ | تقریبا تمام گلیکان های مرتبط با N | تقریبا تمام گلیکان های مرتبط با N | گلیکان مانوز بالا مرتبط با N | شکاف در ساختار دی ساکارید هسته زنجیره سنگین IgG |
| زمان هضم | 10 دقیقه | 1-3 ساعت | 1-3 ساعت | 1 ساعت |
| گلیکوزیلاسیون | مناسب است | مناسب است | مناسب است | مناسب است |
| ساختار پروتئین | مناسب است | مناسب است | مناسب است | مناسب است |
اطلاعات سفارش
| نام محصول | شماره محصول | مشخصات |
| 20406ES20/50 | 20 T/50 T | |
| 20407ES01/02 | 15000 U / 75000 U | |
| 20414ES92/97 | 10000 U / 50000 U | |
| 20413ES80/90 | 1000 U/5 x 1000 U |