تلومراز Teln: یک درایو جدید در سنتز آنزیمی DNA

وقتی صحبت از تلومرها و پروتلومراز می شود در زیست شناسی، ذهن مردم اغلب ابتدا به پیری فکر می کند، یک پدیده طبیعی اجتناب ناپذیر. تلومرها است توالی های DNA تکراری در انتهای کروموزوم های یوکاریوتی که حامل مسئولیت حفظ یکپارچگی کروموزوم و تنظیم چرخه تقسیم سلولی.

پروتلومراز یک آنزیم سنتز DNA ترانس کریپتاز معکوس است که تلومرها را گسترش می دهد. این یک نوکلئوپروتئین است که از RNA و پروتئین تشکیل شده است. جزء پروتئینی می تواند سنتز توالی های تکرار تلومر را کاتالیز کند با جزء RNA

شکل 1. مکانیسم گسترش تلومر با واسطه پروتلومراز^[1]

پروتلومراز می تواند تلومرها را ترمیم و طولانی کند، نقص در همانندسازی DNA را جبران کند، از از دست رفتن تلومر در طول تقسیم سلولی جلوگیری کند و تعداد تقسیمات سلولی را افزایش دهد. در سال 2009، جایزه نوبل فیزیولوژی یا پزشکی به الیزابت اچ بلکبرن، کارول دبلیو گریدر، و جک دبلیو شوستاک برای کمک های برجسته آنها در افشای نقش حیاتی تلومرها و پروتلومراز اهدا شد. در عملکرد سلولی و پیری

امروز می خواهم یک پروتلومراز منحصر به فرد را به شما معرفی کنم: TelN proProtelomerase. پروتلومراز TelN از باکتریوفاژ N15 می آید و جزء سیستم تکثیر N15 است که در آن شرکت می کند در تولید DNA پروفاژ خطی. برخلاف پروتلومراز در یوکاریوت ها، TelN یک آنزیم پروتئینی خالص بدون هیچ گونه جزء RNA است. دارای برش - بستن است فعالیت می کند و پس از برش DNA دو رشته ای (dsDNA) یک انتهای بسته کووالانسی در محل برش باقی می گذارد.

شکل 2. TelN Protelomerase سایت رخ

پروتلومراز TelN مکانیسم عمل

سایت شناسایی TelN Protelomerase یک دنباله پالیندروم است که طول آن 56 جفت باز است و telR و tel در دو طرف آن قرار دارند. موقعیت مرکزی دنباله هدف نیز یک دنباله پالیندروم telO است. پروتلومراز TelN در توالی telO شکاف می دهد و یک ساختار سنجاق سر بسته کووالانسی در دو انتهای برش ایجاد می کند. انتهای DNA پس از هضم همچنان از telR و telL تشکیل شده است که به آن معروف است استخوان سگ DNA (dbDNA).

شکل 3. پروتلومراز مکانیسم برش در سایت TelN^[2]

با توجه به فعالیت ویژه آنزیم برش-بسته شدن TelN Protelomerase، DNA پلاسمید دایره ای می تواند از طریق یک واکنش آنزیمی یک مرحله ای به مولکول های دمبلی شکل بسته کووالانسی خطی تبدیل شود. در مقایسه با مولکول های DNA باز خطی، DNA بسته خطی دارای سطح بیان پروتئین بالاتری در سلول ها است که برای ساختن مینی DNA انتهای بسته خطی با پایداری بالا و حداقل توالی خارجی بسیار مناسب است. DNA پلاسمید به عنوان عنصر اصلی واکسن mRNA، واکسن DNA و ژن درمانی سلولی نقش حیاتی دارد. روش سنتی تولید پلاسمید شامل تخمیر با E. coli و تقویت چند مرحله ای، و خطر غیرقابل کنترل در فرآیند تخمیر، بازده پلاسمید با کیفیت بالا را محدود می کند، که کلیدی برای محدود کردن ظرفیت تولید واکسن می شود. شرکت تاچ لایت در بریتانیا یک فناوری ابتکاری dbDNA را راه اندازی کرده است. این فناوری روش سنتی تخمیر باکتریایی را برای تهیه DNA پلاسمید و به جای استفاده از سنتز آنزیمی DNA در شرایط آزمایشگاهی مختل می کند. فعالیت جداسازی آنزیمی ویژه TelN Protelomerase نیز برای تولید مینی DNA انتهای بسته خطی در روش فوق استفاده می شود.

کاربرد TelN Protelomerase در سنتز آنزیمی DNA

روش آنزیمی DNA در شرایط آزمایشگاهی مبتنی بر phi29 DNA پلیمراز و TelN Protelomerase می تواند از بسیاری از خطرات غیرقابل کنترل در فرآیند تخمیر بیولوژیکی جلوگیری کند و روش آنزیمی آزمایشگاهی می تواند DNA را با سرعت و عملکرد بالا سنتز کند. DNA سنتز شده را می توان در بسیاری از فناوری های نوظهور مانند واکسن mRNA، واکسن DNA، وکتور ژن درمانی و ویرایش ژن استفاده کرد.

شکل 4. نمودار جریان سنتز آنزیمی DNA^[3]

فرآیند سنتز DNA آنزیمی

1. دناتوره سازی الگو

قالب دایره‌ای پلاسمید DNA با فرآیند دناتوراسیون به دو DNA دایره‌ای تک رشته‌ای تبدیل می‌شود.

2. تقویت دایره نورد

تقویت دایره نورد با استفاده از Phi29 DNA پلیمراز و DNA دایره ای تک رشته ای برای تولید DNA concatemeric دو رشته ای بلند خطی با فواصل توالی تشخیص پروتلومراز انجام شد.

3. برش و بسته شدن کووالانسی

TelN Protelomerase telRL روی DNA کمپلکس های تلومری را تشخیص می دهد و فعالیت های برش-بسته شدن را برای تولید مونومرهای DNA خطی و کووالانسی متصل انجام می دهد.

4. حذف DNA ستون فقرات باکتری

اندونوکلئازها یا اگزونوکلئازهای محدود DNA اسکلت باکتری را با ساختاری باز در انتها تجزیه می‌کنند تا DNA حاوی تنها عناصر بیان ژن هدف را به دست آورند. سنتز آنزیمی فناوری DNA تخمیر بیولوژیکی را دور می‌زند و می‌تواند به سرعت به سنتز DNA پلاسمید در سطح GMP دست یابد، محدودیت‌های ظرفیت تولید در زمینه‌های ژن درمانی و mRNA را حل کند. پتانسیل عظیمی برای صنعتی شدن دارد. برای ترویج توسعه فناوری سنتز آنزیمی DNA، YEASEN Biology می‌تواند مواد آنزیمی هسته‌ای را برای سنتز آنزیمی DNA، مانند phi29 DNA polymerase (14404ES) و TelN Protelomerase (14540ES) برای کمک به تحقیق و تولید فناوری سنتز آنزیمی DNA فراهم کند.

پارائه عملکرد از YEASEN پروتلومراز TelN

1. عملکرد Cleavage-ligation عالی است که معادل مارک های وارداتی است.

با استفاده از یک پلاسمید ابرپیچ حاوی محل شناسایی TelN Protelomerase به عنوان یک الگو، آنزیم گرادیان (0.078-5 U) از YEASEN و نام تجاری A اضافه شد. 0.5 میکروگرم از پلاسمید ابرپیچ به DNA دو رشته ای خطی بسته (dsDNA) تبدیل شد. الکتروفورز ژل برای تشخیص راندمان تبدیل استفاده شد و نتایج نشان داد که فعالیت برش و بستن پروتلومراز TelN YEASEN برابر با مارک A است.

شکل 5. تشخیص فعالیت برش پروتلومراز TelN M: نشانگر، C: کنترل پلاسمید فوق سیم پیچ

2. یکپارچگی بسته شدن dsDNA خطی > 90%

با استفاده از پلاسمید ابرپیچ حاوی محل تشخیص TelN Protelomerase به عنوان الگو، افزودن TelN Protelomerase از YEASEN و نام تجاری A، تبدیل 0.5 میکروگرم پلاسمید ابرپیچ به dsDNA خطی بسته و افزودن اگزونوکلئاز T5 برای تشخیص یکپارچگی انتهایی آن از طریق درجه تخریب باند. نتایج نشان داد که یکپارچگی بسته شدن انتهای dsDNA تولید شده توسط TleN Protelomerase از YEASEN بیش از 90٪ بود که معادل با نام تجاری A بود.

شکل 6. تست تمامیت بسته شدن انتهای پروتلومراز TelN. C1: پلاسمید حاوی محل تشخیص TelN، بدون TelN Protelomerase. C2: پلاسمید حاوی محل تشخیص TelN، TelN Protelomerase، بدون اگزونوکلئاز T5. پلاسمید: پلاسمید حاوی محل تشخیص TelN.

محصولات مرتبط از سنتز آنزیمی DNA

طبقه بندی محصول	نام محصول	شماره کاتالوگ
پروتلومراز	پروتلومراز TelN (5 U/μL)	14540ES
Phi29 DNA پلیمراز	phi29 DNA پلیمراز (10 U/μL)	14404ES
اگزونوکلئاز	اگزونوکلئاز III	14525ES
	اگزونوکلئاز T5 (U/µL 10)	14538ES
dNTP	dNTP Mix (هر کدام 25 میلی‌مولار)	10125ES

آرارجاعات

[1] Giardini MA، Segatto M، da Silva MS، Nunes VS، Cano MI. تلومر و پروتلومراز زیست شناسی Prog Mol Biol Transl Sci. 2014؛ 125: 1-40.

[2] Heinrich J، Schultz J، Bosse M، Ziegelin G، Lanka E، Moelling K. مینی DNA بسته خطی تولید شده توسط آنزیم شکاف-پیوستن پروکاریوتی TelN در سلول های پستانداران کاربردی است. جی مول مد (برل). 2002؛ 80 (10): 648-654.

[3] Heinrich J، Schultz J، Bosse M، Ziegelin G، Lanka E، Moelling K. مینی DNA بسته خطی تولید شده توسط آنزیم شکاف-پیوستن پروکاریوتی TelN در سلول های پستانداران کاربردی است. جی مول مد (برل). 2002؛ 80 (10): 648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.