از مارس 2022، سویه حیله گر جهش یافته Omicron بار دیگر زندگی مسالمت آمیز مردم را شکست، اپیدمی های جدید کروناویروس در سراسر کشور شیوع یافت و 30 استان (مناطق و شهرداری های خودگردان) را تحت تاثیر قرار داد. به عنوان یک ابزار موثر برای پیشگیری و کنترل دقیق اپیدمی SARS-CoV-2، تشخیص اسید نوکلئیک به یک روش عادی زندگی تبدیل شده است. "آیا امروز آزمایش اسید نوکلئیک را انجام دادید؟" به سلام روزانه مردم هم تبدیل شده است. در مورد آن، آیا می دانید چه مواد خام اصلی در تشخیص اسید نوکلئیک مورد نیاز است؟ این مقاله به معرفی مواد خام اصلی در آنزیم تشخیص نوکلئیک اسید می پردازد.

1. فرآیند تشخیص اسید نوکلئیک برای SARS-CoV-2

2. آنزیم های اصلی در استخراج اسید نوکلئیک

3. آنزیم های هسته در طول RT-qPCR

4. آنزیم های اصلی تشخیص اسید نوکلئیک SARS-CoV-2 از Yeasen

1. فرآیند تشخیص اسید نوکلئیک برای SARS-CoV-2

آنزیم یک کلاس بسیار مهم از بیوکاتالیست ها با راندمان کاتالیزوری بالا و ویژگی واکنش است. اکثر واکنش های بیوشیمیایی نیاز به مشارکت آنزیم ها دارند. در فرآیند تشخیص اسید نوکلئیک 2019-nCoV (نشان داده شده در شکل 1)، انواع مختلف آنزیم های مولکولی نقش مهمی در مراحل مختلف آزمایشی مانند استخراج اسید نوکلئیک و RT-qPCR ایفا می کنند. در مرحله بعد، با توجه به پیوندهای تجربی مختلف در تشخیص اسید نوکلئیک، مواد خام آنزیمی هسته مورد استفاده در فرآیند تشخیص اسید نوکلئیک را مرتب خواهیم کرد.

شکل 1. فرآیند تشخیص اسید نوکلئیک برای SARS-CoV-2

2. آنزیم های اصلی در استخراج اسید نوکلئیک

فرآیند استخراج اسید نوکلئیک کروناویروس جدید عمدتاً شامل دو مرحله است: لیز و خالص سازی. لیز فرآیند تخریب ساختار سلولی نمونه است به طوری که اسید نوکلئیک موجود در نمونه در سیستم لیز آزاد باشد. خالص سازی جداسازی کامل اسید نوکلئیک از سایر اجزای سیستم لیز مانند پروتئین، نمک و سایر ناخالصی ها است و فرآیند واکنش نیاز به مشارکت پروتئیناز K، دئوکسی ریبونوکلئاز I و مهارکننده های RNase دارد.

2.1 پروتئاز K

پروتئیناز K یک پروتئاز سرین با فعالیت برش گسترده است، محل های برش پیوندهای پپتیدی کربوکسی پایانی اسیدهای آمینه آلیفاتیک و آروماتیک هستند (شکل 2). در فرآیند استخراج اسید نوکلئیک، پروتئیناز K می‌تواند هیستون‌هایی را که به شدت با اسیدهای نوکلئیک متصل هستند، تجزیه کند، جداسازی اسیدهای نوکلئیک را افزایش داده و استخراج اسید نوکلئیک نمونه را آسان‌تر کند. علاوه بر این، پروتئیناز K می تواند فعالیت RNA هیدرولاز (RNase) را کاهش داده و هیدرولیز RNase RNA الگو را مهار کند.

شکل 2. نمودار شماتیک پیوندهای پپتیدی هیدرولیزکننده پروتئیناز K

Yeasen Biotech پروتئیناز K (Cat#10401ES) از سویه مخمر نوترکیب، فعالیت ویژه ≥30 U/mg، عاری از RNase و DNase و فعالیت آنزیمی پایدار در محلول اوره و SDS مشتق شده است. این در محدوده وسیعی از pH (pH 4.0 ~ 12.0) فعال است، مناسب برای برش و حذف پروتئین ها مانند آماده سازی نمونه هیبریداسیون درجا و خالص سازی اسید نوکلئیک.

2.2 دئوکسی ریبونوکلئاز I

دئوکسی ریبونوکلئاز I (DNase I) می تواند اشکال مختلف DNA را کاتالیز کند، پیوندهای فسفودی استر مجاور پیریمیدین ها را هدف قرار دهد و پلی نوکلئوتیدهایی با گروه فسفات در انتهای 5 و یک گروه هیدروکسیل در انتهای 3' تولید کند، متوسط ​​محصول هضم پلی تترانو کوچکترین است.در فرآیند استخراج اسید نوکلئیک SARS-CoV-2، DNase I عمدتاً برای حذف آلودگی ژنومی در نمونه‌های RNA، اجتناب از باقی‌مانده‌های DNA در قالب‌های RNA و بهبود خلوص الگوها استفاده می‌شود.

Yeasen Biotech DNase I (Cat#10325ES) از سویه های E. coli نوترکیب، بدون RNase مشتق شده است و می تواند برای درمان نمونه های مختلف RNA استفاده شود. محدوده pH کاری بهینه 7.0-8.0 است. در حضور Mg2+، DNase I می‌تواند هر محل از DNA دو رشته‌ای را به‌طور تصادفی جدا کند. در حالی که در حضور من²⁺، DNase I می تواند DNA دو رشته ای را در همان محل شکاف دهد و انتهای صاف یا انتهای چسبناک 1-2 نوکلئوتیدی را تشکیل دهد (نشان داده شده در شکل 3).

شکل 3. نمودار شماتیک dsDNA برش DNase I در حضور Mg²⁺ و منگنز²⁺

2.3 مهارکننده RNase

در فرآیند تشخیص اسید نوکلئیک SARS-CoV-2، استخراج و خالص‌سازی اسید نوکلئیک نمونه یا تهیه سیستم واکنش آزمایشی ممکن است باعث آلودگی ریبونوکلئاز (RNase) شود که منجر به تخریب الگوی RNA می‌شود. برای جلوگیری از آلودگی RNase، RNase Inhibitor مورد نیاز است.

RNase Inhibitor یک مهارکننده RNase خاص در جفت انسان است که می تواند به طور خاص RNase را برای تشکیل یک کمپلکس با یک پیوند غیرکووالانسی متصل کرده و RNase را غیرفعال کند. Yeasen Biotech مهارکننده RNase موشی (Cat#10603ES) حاوی دو سیستئین نیست که به اکسیداسیون پروتئین های انسانی بسیار حساس هستند. فعالیت آنتی اکسیدانی بالاتری دارد و می تواند به طور گسترده ای انواع مختلفی از RNase ها (RNase A, B, C) را مهار کند که برای آزمایش های حساس به دی تیوتریتول بالا (DTT) مانند qPCR مناسب تر است.

3. آنزیم های هسته در طول RT-qPCR

پس از اتمام استخراج اسید نوکلئیک از نمونه SARS-CoV-2، تشخیص اسید نوکلئیک می تواند توسط RT-qPCR تکمیل شود. در فرآیند این آزمایش‌ها، DNA پلیمراز، ترانس کریپتاز معکوس و اوراسیل DNA گلیکوزیلاز، همگی مواد خام اصلی آنزیم هستند.

3.1 ترانس کریپتاز معکوس

پس از استخراج و خالص‌سازی، RNA SARS-CoV-2 برای کاتالیز کردن پلیمریزاسیون dNTP برای تولید یک توالی cDNA مکمل RNA الگو به رونویسی معکوس نیاز دارد (شکل 4). برای واکنش RT-qPCR، ترانس کریپتاز معکوس مقاوم در برابر دمای بالا باید انتخاب شود. در حال حاضر، ترانس کریپتاز معکوس MMLV بیشترین استفاده را دارد، زیرا به دلیل عدم فعالیت اندونوکلئاز DNA و فعالیت کم RNase H، مزایای بیشتری در کاربرد شبیه سازی cDNA دارد.

شکل 4. نمودار شماتیک فرآیند رونویسی معکوس

Yeasen Biotech Hifair™ V رونوشت معکوس (Cat#11300ES) یک ترانس کریپتاز معکوس جدید است که توسط فناوری مهندسی ژنتیک به دست آمده است. پایداری حرارتی خوبی دارد و می تواند دمای واکنش تا 60 درجه سانتی گراد را تحمل کند. و همچنین است مناسب برای رونویسی معکوس الگوهای RNA با ساختارهای ثانویه پیچیده. در عین حال، آنزیم میل ترکیبی را با الگو افزایش می دهد، برای رونویسی معکوس تعداد کمی از الگوها و ژن های کم کپی مناسب است و می تواند cDNA را تا 10 کیلوبایت تقویت کند.

3.2 DNA پلیمراز

پس از تکمیل فرآیند رونویسی معکوس الگو برای تولید cDNA دو رشته‌ای، DNA پلیمراز «بازیگر روح» در واکنش PCR لازم است تا با پلیمریزه کردن دئوکسی ریبونوکلئوتیدهای آزاد برای گسترش زنجیره DNA ظاهر شود و مقدار زیادی از DNA الگو در شرایط آزمایشگاهی برای دستیابی به هدف تشخیص اسید نوکلئیک ویروسی تقویت می‌شود.

DNA پلیمرازی که معمولاً در واکنش های RT-qPCR استفاده می شود، Taq DNA پلیمراز با شروع داغ است. این نوع آنزیم در دمای اتاق غیر فعال است.فعالیت پلیمریزاسیون آن تنها پس از شروع گرم است که می تواند تولید سیگنال های پس زمینه را به حداقل برساند. مشکلات تقویت غیر اختصاصی ناشی از تولید پرایمر-دایمر یا عدم تطابق در واکنش های PCR معمولی را حل می کند. در حال حاضر، روش‌های متداول اصلاح شروع داغ DNA پلیمراز عمدتاً شامل اصلاح شیمیایی، اصلاح لیگاند و اصلاح آنتی‌بادی است. اصول روش های مختلف اصلاح شروع داغ در شکل 5 نشان داده شده است.

شکل 5. نمودار شماتیک انواع مختلف آنزیم های شروع گرم اصلاح شده

Yeasen Biotech UNICONTM Hotstart High Specific Taq DNA Polymerase، 5 U/μL (Cat#10726ES) یک DNA پلیمراز شروع داغ با دو بلوک کننده با میل ترکیبی بالا است. در دمای اتاق، نه تنها 5'→3' فعالیت پلیمراز مسدود شده است، اما همچنین 5'→3' فعالیت اگزونوکلئاز مسدود شده است. دناتوراسیون در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه می تواند آنتی بادی مسدود کننده را به طور کامل غیرفعال کند و فعالیت DNA پلیمراز و فعالیت اگزونوکلئاز را آزاد کند. ویژگی مسدود کردن دوگانه نه تنها می تواند به طور موثر از تقویت غیر اختصاصی ناشی از عدم تطابق یا پرایمر-دایمرها جلوگیری کند، بلکه به طور موثری از کاهش سیگنال فلورسانس ناشی از تخریب پروب جلوگیری می کند. گارانتی مضاعف باعث می شود که معرف های تشخیص آزمایشگاهی در هنگام حمل و نقل یا استفاده در دمای اتاق پایدارتر شوند.

3.3 اوراسیل DNA گلیکوزیلاز

در فرآیند تشخیص اسید نوکلئیک کروناویروس جدید، آلودگی آئروسل در محیط عملیاتی رایج‌ترین عامل ایجاد نتایج PCR مثبت کاذب است. افزودن آنزیم UDG (Uracil DNA Glycosylase، uracil DNA glycosylase) به سیستم تقویت می تواند به طور موثری آلاینده های باقی مانده تقویت (عمدتا به شکل ذرات معلق در هوا) مخلوط شده در سیستم PCR را حذف کند تا از صحت نتایج تقویت اطمینان حاصل شود. اصل ضد آلودگی آنزیم UDG در شکل 6 نشان داده شده است.

شکل 6. نمودار شماتیک اصل ضد آلودگی آنزیم UDG

Yeasen Biotech Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG)، حساس به حرارت، 1 U/μL (Cat#10303ES) در دمای 25-37 درجه سانتیگراد فعال است، حساس به حرارت است و در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه یا 95 درجه سانتیگراد به مدت 2 دقیقه غیرفعال می شود. هیچ باقی مانده اندونوکلئاز و RNase وجود ندارد و باقیمانده ژنوم باکتری میزبان کمتر از 10 نسخه است. می توان آن را همراه با شروع داغ Taq DNA پلیمراز برای اطمینان از ویژگی واکنش تقویت استفاده کرد.

4.آنزیم های اصلی تشخیص اسید نوکلئیک SARS-CoV-2 از Yeasen

در مورد خواندن:

انتخاب رونوشت معکوس

YEASEN UDG حساس به گرما——آلودگی آئروسل را به راحتی کنترل کنید

مهارکننده‌های RNase موشی - آلودگی RNase را با موفقیت از بین می‌برد و RNA را حفظ می‌کند