dNTP مخفف ریبونوکلئوتید تری فسفات الگودار مورد استفاده در PCR است که قادر به تقویت یک رشته DNA در حال رشد است. به عبارت دیگر، dNTP ها در PCR با رشته های DNA مکمل از طریق پیوندهای هیدروژنی، و رشته های DNA در حال رشد با کمک DNA پلیمراز Taq منبسط می شوند. کاربرد خاص dNTP در PCR چیست؟ dNTP های با خلوص بالا باید چه ویژگی هایی داشته باشند؟

1. dNTP چیست؟
2. غلظت dNTP در PCR چقدر است؟
3. خواص مورد نیاز dNTP با خلوص بالا چیست؟
4. محصولات مرتبط و عملکرد

1. dNTP چیست؟

تری فسفات های دئوکسی نوکلئوزید (dNTPs) تری فسفات های نوکلئوزیدی حاوی دئوکسی ریبوز، زنجیره ای از نوکلئوتیدها متشکل از ریبوز، یک باز و یک فسفات هستند. dNTPها بلوک‌های ساختمانی ضروری مولکول‌های اسید نوکلئیک هستند و به این ترتیب اجزای ضروری مخلوط‌های PCR هستند زیرا هیچ DNA تقویت‌شده جدیدی بدون آن‌ها تولید نمی‌شود. چهار دئوکسی نوکلئوتید مجزا که یک توالی DNA شامل دئوکسی آدنوزین تری فسفات (dATP)، دئوکسی تیمیدین تری فسفات (dTTP)، دئوکسی سیتیدین تری فسفات (dCTP) و دئوکسی گوانوزین تری فسفات (dGTP) را تشکیل می دهند. علاوه بر این، کیفیت dNTPها برای موفقیت بسیاری از روش‌ها مانند PCR، سنتز cDNA، qPCR، توالی‌یابی، شبیه‌سازی و برچسب‌گذاری DNA حیاتی است.

چهار نوع dNTP یا دئوکسی نوکلئوتید تری فسفات وجود دارد که هر کدام از یک پایه DNA متفاوت استفاده می کنند: آدنین (dATP)، سیتوزین (dCTP)، گوانین (dGTP) و تیمین (dTTP). استفاده از dNTP در مرحله گسترش، پایه های منفرد را آماده می کند تا وارد DNA شوند و آن را دو برابر کنند، مانند بلوک های ساختمان. از آنجایی که هدف این تکنیک سنتز DNA جدید است، dNTP با استفاده از الگوی یک طرف، نوکلئوتیدها را به رشته "زیپ نشده" ارائه می دهد. این یک رشته DNA را به دو رشته تبدیل می‌کند و تا زمانی که معرف‌ها تا مرحله نگهداری نهایی باقی می‌مانند، می‌تواند به صورت تصاعدی ادامه یابد.

2. غلظت dNTP در PCR چقدر است؟

PCR یک تکنیک in vitro سنتز DNA است که برای تولید کپی های متعدد از یک قطعه DNA مورد علاقه انجام می شود تا بتوان آن را تحت الکتروفورز ژل مشاهده کرد. هدف از PCR ایجاد تعداد زیادی کپی از DNA برای کاربردهای مختلف پایین دست در توالی یابی DNA یا ریزآرایه های DNA است. اجزای آن شامل الگوهای DNA، پرایمرها، بافرها و Taq DNA پلیمراز dNTP است. برای درک مکانیسم PCR، درک اهمیت و اصل اجزای مورد استفاده ضروری است. dNTP یکی از اجزای کلیدی PCR است. عملکرد dNTP ها در PCR تقویت رشته DNA در حال رشد با کمک Taq DNA پلیمراز و ترکیب با رشته DNA مکمل از طریق پیوند هیدروژنی است.

فرآیند PCR به سه مرحله وابسته به دما تقسیم می شود: دناتوراسیون، بازپخت و گسترش. در مرحله دناتوراسیون، DNA دو رشته ای به DNA تک رشته ای دناتوره می شود. در مرحله بازپخت، پرایمرها در محل دقیق توالی تکمیلی خود متصل می شوند و در مرحله گسترش، Taq DNA پلیمراز dNTPs را به رشته DNA در حال رشد اضافه می کند. پس از باز شدن رشته ها و اتصال پرایمرها به DNA تک رشته ای، Taq DNA پلیمراز فعالیت کاتالیزوری خود را آغاز می کند. در مرحله بعد، افزودن dNTPs شروع می شود که در صورت وجود نوکلئوتید مکمل دقیق، با میل ترکیبی کمتری به کمپلکس P-DNA متصل می شود. اندکی پس از باقی ماندن Taq DNA پلیمراز، برهمکنش های پیوند هیدروژنی بین بازهای مکمل و dNTP ها رخ می دهد. در اینجا این کل نوکلئوتید در ابتدا نیست، بلکه پایه (پایه نیتروژن) روی dNTP است که تصمیم می‌گیرد که آیا متصل شود یا نه.ابتدا، اگر یک پایه مکمل (A برای T، G برای C) در الگوی ssDNA پیدا کند، بین آنها پیوند هیدروژنی ایجاد می کند. سه پیوند هیدروژنی بین C و G و دو پیوند هیدروژنی بین A و T ایجاد می شود. هنگامی که پیوند هیدروژنی تشکیل شد، Taq DNA پلیمراز با ادغام dNTP به رشته DNA در حال رشد با تشکیل یک پیوند فسفودی استر مطابقت دارد. اکنون پس از تشکیل پیوند فسفودی استر، Taq DNA پلیمراز در افزودن dNTP های جدید قدمی فراتر می گذارد. یک پیوند فسفودی استر بین 3'OH پرایمر و 5'P dNTP تشکیل می شود. پس از پیوند هیدروژنی، Taq DNA پلیمراز واکنش را با حذف گاما و بتا فسفات از تری فسفات های dNTP ها کاتالیز می کند. پس از تکمیل واکنش، دو پیروفسفات (PPi) آزاد می شود. اما سینتیک دقیق برهمکنش dNTPs و Taq پلیمراز در واکنش‌های PCR ناشناخته باقی مانده است.

این چهار نوکلئوتید معمولاً در مقادیر هممولار به واکنش PCR اضافه می‌شوند تا پایه بهینه را ادغام کنند. با این حال، در موقعیت‌های خاصی مانند جهش‌زایی تصادفی توسط PCR، غلظت‌های نامتعادل dNTP عمداً برای ارتقای درجه بالاتری از ادغام نادرست توسط یک DNA پلیمراز غیر تصحیح‌کننده عرضه می‌شوند. عاملی که حداقل غلظت dNTP را تعیین می کند، طول DNA و ترکیب توالی هدف است. در واکنش PCR، dNTP به طور کلی 50-200 میکرومول در لیتر است. هنگامی که غلظت نهایی dNTP بیشتر از 50 میلی مول در لیتر باشد، می تواند فعالیت Taq DNA پلیمراز را مهار کند. غلظت چهار dNTP باید برابر باشد تا به دلیل کمبود یک dNTP، ادغام نادرست در طول تقویت کاهش یابد.

در کاربردهای معمول PCR، غلظت نهایی توصیه شده برای هر dNTP معمولاً 0.2 میلی مولار است. غلظت های بالاتر ممکن است در برخی موارد مفید باشد، به ویژه در حضور غلظت های بالای منیزیم²⁺، به عنوان Mg²⁺ به dNTP ها متصل می شود و نرخ ادغام آنها را کاهش می دهد و نرخ غیر اختصاصی را افزایش می دهد. dNTP حاوی فسفات است که می تواند با منیزیم ترکیب شود²⁺ برای کاهش غلظت Mg آزاد²⁺بنابراین تغییر غلظت آن بر غلظت موثر منیزیم تأثیر می گذارد²⁺. تحت شرایط غلظت بالای DNA و dNTP، Mg²⁺ غلظت باید بر این اساس تنظیم شود. همچنین کمبود dNTP منجر به ناقص بودن محصولات PCR می شود. با این حال، dNTP ها بیش از غلظت بهینه می توانند PCR را مهار کنند. برای ادغام کارآمد توسط DNA پلیمراز، dNTP های آزاد باید در غلظت کمتر از 0.01-0.015 میلی مولار در واکنش وجود داشته باشند.

3. خواص مورد نیاز dNTP با خلوص بالا چیست؟

از زمان کشف، واکنش زنجیره ای پلیمراز ابزار بی بدیلی است که در تحقیقات ژنتیک مولکولی استفاده می شود. dNTP در PCR برای گسترش رشته DNA در حال رشد استفاده می شود. حتی اگر کیفیت dNTP در سیستم ضعیف باشد، تأثیر منفی بر خواص محصول نهایی خواهد داشت. dNTP با خلوص بالا Yeasen برای انواع کاربردهای سنتز DNA بسیار حساس و قابل تکرار مناسب است.

Yeasen نوکلئوتیدها، مجموعه‌ها و مخلوط‌های آماده برای استفاده با درجه GMP را ارائه می‌دهد که به صورت نمک سدیم در آب تصفیه شده با pH 7.0 عرضه می‌شوند. فرآیند تولید ناخالصی‌ها و مهارکننده‌های خاص PCR را حذف می‌کند و dNTP‌ها به‌طور ویژه برای کاربردهای زیست‌شناسی مولکولی تولید می‌شوند. dNTP ها با HPLC آماده سازی خالص می شوند و حداقل 99 درصد خلوص دارند. آنها را می توان در فرآیندهای PCR، RT-qPCR، LAMP، برچسب گذاری DNA و توالی یابی DNA استفاده کرد.
استانداردهای کنترل دقیق و تکنولوژی پیشرفته، بهترین کیفیت محصول را تضمین می کند. هر مقدار dNTP برای باقی مانده های مختلف (DNA باکتری، DNA انسان، DNase، RNase، اندونوکلئاز) آزمایش می شود.این محصول از دسته ای به دسته دیگر پایدار است و برای انواع کاربردهای سنتز DNA بسیار حساس و قابل تکرار مناسب است.

4. محصولات مرتبط و عملکرد

4.1 بدون باقیمانده DNA باکتریایی

شکل 1. نتایج تشخیص نشان می دهد که dNTP ها هیچ باقیمانده ژنوم باکتریایی ندارند.

4.2 بدون باقی مانده DNA انسان

شکل 2. نتایج تشخیص نشان می دهد که dNTP ها هیچ باقیمانده ژنوم انسانی ندارند.

4.3 بدون آلودگی DNase، RNase و Endonuclease

شکل 3. نتایج تشخیص نشان می دهد که dNTP ها DNase، RNase و Endonuclease ندارند.

4.4 تقویت PCR (20 کیلوبایت DNA)

شکل 4. نتیجه تقویت PCR محصول 20 کیلوبایتی مورد انتظار است.

4.5 اطلاعات محصولات

محصولات ارائه شده توسط Yeasen به شرح زیر می باشد.

جدول 1.اطلاعات محصولات