PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز) یک تکنیک سنگ بنای زیست شناسی مولکولی است که به طور گسترده برای شبیه سازی ژن، آزمایش های تشخیصی و تحقیقات استفاده می شود. در حالی که سریع، کارآمد و بسیار خاص است، حتی محققان باتجربه گاهی اوقات می توانند با مشکلات ظریفی روبرو شوند که می تواند بر نتیجه آزمایشات آنها تأثیر بگذارد. برای کمک به شما در عیب‌یابی و بهینه‌سازی آزمایش‌های PCR، این راهنمای رایگان را با ۵ نکته ضروری که ممکن است در نظر نگرفته‌اید، گردآوری کرده‌ایم. با تنظیم دقیق این جزئیات کوچک، نتایج بهتر، بازدهی بهتر و تقویت‌های غیر اختصاصی کمتری خواهید دید.
اصل PCR
درک PCR: اصول
در هسته آن PCR است یک بخش DNA خاص را با تکرار یک سری مراحل مبتنی بر دما تقویت می کند: دناتوراسیون، بازپخت و گسترش. از طریق این چرخه ها، آنزیم DNA پلیمراز رشته های جدیدی از DNA را سنتز می کند و مقدار DNA را با هر چرخه دو برابر می کند. پس از تعداد کافی چرخه، قطعه DNA هدف شما قابل تشخیص می شود.
بازده PCR معمولاً از یک منحنی رشد نمایی پیروی می کند و DNA در هر چرخه دو برابر می شود تا زمانی که به فاز فلات می رسد. فرمول استاندارد PCR:
بازده محصول PCR = 2^N کپی (که در آن N تعداد چرخه ها است).
با این حال، با افزایش چرخه ها، معرف هایی مانند Taq polymerase، dNTPs و پرایمرها مصرف می شود و محصولات جانبی می توانند جمع شوند و منجر به فلات شوند.
منحنی تقویت PCR
درک و بهینه سازی این منحنی کلید دستیابی به نتایج PCR با کیفیت است.
1. تنظیم شرایط دوچرخه‌سواری PCR شما
یکی از حیاتی ترین مراحل در بهینه سازی PCR، تنظیم پارامترهای دوچرخه سواری است.
دام شماره 1: چرخه های خیلی کم
اگر چرخه های کافی را اجرا نکنید، به خصوص با غلظت های پایین الگو، ممکن است DNA هدف شما به اندازه کافی تقویت نشود. به طور معمول، 30-40 سیکل برای تقویت قوی توصیه می شود. اگر الگوی شما پراکنده است، از رفتن به سمت بالاترین محدوده نترسید.
دام شماره 2: چرخه های بیش از حد
اگرچه ممکن است افزایش تعداد چرخه ها برای افزایش بازده وسوسه انگیز به نظر برسد، دوچرخه سواری بیش از حد می تواند منجر به تقویت های غیر اختصاصی و مثبت کاذب شود. واکنش معمولاً پس از 25-35 چرخه به حداکثر بازده خود می رسد، پس از آن وارد فاز فلات می شود که در آن افزایش قابل توجهی در محصول رخ نخواهد داد.
نکته: برای جلوگیری از این، از یک معرف PCR با کارایی بالا مانند استفاده کنید Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix (Cat# 10167ES)، که می تواند رکود واکنش را کاهش دهد و تنها در 30-35 چرخه به بازده بالا دست یابد.
شکل 1: 10167 یک کلنی 576 جفت باز E. coli را تقویت می کند، با منبع ژنی از Arabidopsis thaliana که از محصولات رقیب بهتر عمل می کند. زمان گسترش 30 ثانیه بر کیلوبایت است و تقویت با 34 سیکل انجام شد.
2.طراحی پرایمر خود را کامل کنید
طراحی پرایمر پایه و اساس هر آزمایش PCR است و اشتباهات کوچک در اینجا می توانند کل واکنش شما را از مسیر خارج کنند.
دام شماره 1: نادیده گرفتن ترکیب پایانی 3
در حالی که بسیاری از محققان بر روی محتوای GC و طول پرایمر تمرکز می کنند، انتهای 3' پرایمر شما یک ملاحظ مهم است. در حالت ایده‌آل، چند پایه آخر باید G یا C باشند تا پایداری اتصال پرایمر-قالب افزایش یابد و پرایمر نادرست یا عدم تطابق کاهش یابد.
دام شماره 2: غلظت نادرست پرایمر
اگر غلظت پرایمر شما خیلی بالا باشد، احتمال وجود دایمرهای پرایمر یا اتصال غیر اختصاصی را افزایش می دهید. برعکس، اگر خیلی کم باشد، ممکن است به تقویت کافی نرسید. غلظت بهینه پرایمر نهایی معمولاً بین 0.4 تا 0.5 میکرومولار است.
نکته: همانطور که توسط Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix کیت سازگاری در اینجا خطاهای کمتر و نتایج قابل اعتمادتر را تضمین می کند.
| اجزاء | حجم (μL) | حجم (μL) | غلظت نهایی |
| 2×هیف® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix* | 25 | 12.5 | 1× |
| الگو** | x | x | - |
| Forward Primer F(10 میکرومولار)*** | 2 | 1 | 0.4-0.5 میکرومولار |
| پرایمر معکوس R (10 میکرومولار) | 2 | 1 | 0.4-0.5 میکرومولار |
| ddH2O | تا 50 | تا 25 | - |
3. مراقب کیفیت و کمیت DNA الگو باشید
DNA الگو نقش اساسی در واکنش های PCR شما ایفا می کند و مشکلات کیفیت یا غلظت می تواند منجر به تقویت ضعیف شود.
دام شماره 1: تخریب DNA الگو
DNA می تواند در طول زمان تخریب شود، به خصوص زمانی که به درستی ذخیره نشود. اطمینان حاصل کنید که به طور منظم غلظت الگوی خود را آزمایش می کنید، به خصوص اگر برای مدت طولانی ذخیره شده باشد.همیشه قبل از شروع آزمایش، DNA را مجدداً تعیین کنید تا از نتایج دقیق اطمینان حاصل کنید.
دام شماره 2: تکنیک های نادرست مدیریت الگو
برای ارگانیسم‌های خاصی مانند مخمر، آماده‌سازی الگو می‌تواند بازی را تغییر دهد. به عنوان مثال، هنگام کار با مخمر، جوشاندن سلول ها به مدت 5 دقیقه و سپس انجماد آنها در 80- درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه قبل از ذوب می تواند عملکرد PCR را به شدت بهبود بخشد.
10167ES تقویت مخمر
نکته: همیشه از DNA الگوی تازه تهیه شده و با کمیت مناسب استفاده کنید. اگر با الگوهای سخت تری (مانند مخمر) کار می کنید، پروتکل های استخراج خود را برای نتایج بهتر بهینه سازی کنید.
4. از آلودگی در معرف های خود اجتناب کنید
آلودگی در معرف های شما اغلب یک علت نادیده گرفته شده برای شکست PCR است. این هم شامل آلودگی فیزیکی از پیپت ها و هم آلودگی متقابل بین معرف های شما می شود.
دام شماره 1: آلودگی متقابل معرفها
معرف های PCR مانند پرایمرها اغلب در معرض چرخه های متعدد انجماد و ذوب قرار می گیرند که می تواند خطر آلودگی را افزایش دهد. بسیار مهم است که همیشه پرایمرها را به عنوان یکی از آخرین اجزای واکنش خود اضافه کنید تا این خطر را به حداقل برسانید.
دام شماره 2: تقویت غیر اختصاصی
اگر پرایمرها به ترتیب صحیح اضافه نشوند، یا اگر نوک پیپت ها بین هر مرحله تغییر نکنند، ممکن است آلودگی متقاطع بین واکنش ها رخ دهد که منجر به تقویت غیر اختصاصی شود.
نکته: ترتیب بهینه افزودن معرف ها را دنبال کنید: آب → پرایمرها → قالب → آنزیم های مخلوط PCR. این به جلوگیری از مسائل آلودگی کمک می کند و واکنش های شما را تمیز و قابل اعتماد نگه می دارد.
5. مخلوط PCR و افزودنی های مناسب را انتخاب کنید
همه مخلوط‌های PCR یکسان ایجاد نمی‌شوند، و انتخاب درست می‌تواند در موفقیت آزمایش شما تفاوت ایجاد کند.
دام شماره 1: استفاده از مخلوط های PCR ضعیف
برخی از مخلوط‌های PCR در رسیدگی به قالب‌های پیچیده یا محتوای GC زیاد مؤثر نیستند. برای واکنش های چالش برانگیز، استفاده از ترکیبی با کارایی بالا را در نظر بگیرید که برای تقویت سریع و کارآمد طراحی شده است.
نکته: توصیه می کنیم استفاده کنید Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix (Cat# 10167ES)، که زمان افزایش سریعتر و عملکرد بهتر را با قالب های دشوار ارائه می دهد. توانایی آن برای کنترل محتوای GC بالا و قطعات بزرگ بی نظیر است و بازدهی بالاتری را در دوره های کوتاه تر برای شما فراهم می کند.
نمایش عملکرد
- تقویت سریع و کارآمد کلنی
شکل 1: آزمایش تقویت زمان طولانی برای کلنی E. coli. برای قطعات در 3 کیلوبایت، 10167ES بازدهی گسترش 1 ثانیه در کیلوبایت را به دست می آورد.، برای قطعات 6 کیلوبایتی راندمان پسوند 3 ثانیه بر کیلوبایت و برای قطعات 10-6 کیلوبایتی راندمان به 5 ثانیه در کیلوبایت می رسد. M: نشانگر 10000 DNA (10505ES).
- تقویت سریع و کارآمد قطعات طولانی و مایعات باکتریایی با GC بالا
شکل 2: تقویت قطعات طولانی و مایعات باکتریایی با GC بالا نشان می دهد که 10167ES مقادیر بالاتری را با نرخ تشخیص 100٪ تولید می کند و از محصولات رقیب بهتر عمل می کند.. M: نشانگر 10000 DNA (10505ES). سرعت توسعه 10167ES 10 ثانیه در کیلوبایت است، در حالی که محصولات رقیب 15 ثانیه در کیلوبایت طول می کشند.
نتیجه گیری: جزئیات کوچک، تاثیر بزرگ
بهینه سازی PCR فقط به دنبال پیروی گام به گام پروتکل نیست، بلکه درک این است که چگونه تغییرات کوچک می تواند نتایج شما را به طور چشمگیری بهبود بخشد. از تنظیم دقیق شرایط چرخه تا اطمینان از کیفیت معرف های شما، توجه به این جزئیات می تواند آزمایش PCR شما را شکست دهد یا خراب کند.
با صرف زمان برای بهینه سازی پروتکل های خود و استفاده از معرف های مناسب مانند Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix، می توانید کارایی و خروجی PCR خود را به میزان قابل توجهی افزایش دهید. به یاد داشته باشید، در حوزه PCR، شیطان در جزئیات است.
آیا برای بهبود نتایج PCR خود آماده اید؟ امروز محصولات ما را کاوش کنید و اجازه دهید Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix تحقیقات خود را به سطح بعدی ارتقا دهید!
درباره Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix
این مخلوط PCR نسل بعدی برای تقویت سریع، کارآمد و با بازده بالا طراحی شده است. فرقی نمی‌کند با کلنی‌های باکتریایی، قالب‌های دشوار یا محتوای GC بالا کار می‌کنید، این ترکیب به شما کمک می‌کند با زمان کمتر و چرخه‌های کمتر به نتایج مطلوب برسید.
نسخه ارتقا یافته Fast PCR Master Mix
2×هیف® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix
سریع، کارآمد، توقف رکود، و افزایش بازده
| موقعیت یابی محصول | نام | شماره کاتالوگ | مشخصات |
| PCR سریع ارتقا یافته، مناسب برای PCR باکتریایی و تقویت الگوی پیچیده | 2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix | 1 میلی لیتر/5×1 میلی لیتر | |
| سریعترین شبیه سازی 5 دقیقه ای یک مرحله ای برای 1-7 قطعه. | کیت کلونینگ یک مرحله ای Hieff Clone® Universal II | 20 T/50 T |
برای اطلاعات بیشتر یا خرید به ما مراجعه کنید وب سایت رسمی.