بهینه سازی تولید صنعتی و تصفیه mRNA خود سازگار

علیرغم دستیابی به نتایج خوب در طول همه گیری و نشان دادن پتانسیل زیاد، فناوری mRNA هنوز دارای محدودیت های متعددی مانند زمان بیان کوتاه و ترجمه محدود پروتئین است. در حالی که این ویژگی‌ها می‌توانند سطح خاصی از ایمنی را فراهم کنند، اما به محدودیت‌هایی برای درمان‌هایی مانند جایگزینی پروتئین تبدیل می‌شوند. این نیاز به دوز مکرر برای حفظ سطح بیان پروتئین، ایجاد خطرات و چالش های جدید مانند ایمنی زایی و خنثی کردن آنتی بادی ها دارد.

RNA خودتقویت شونده (saRNA) می تواند همان پاسخ ایمنی را در دوزهایی صدها یا حتی هزاران بار کوچکتر از mRNA سنتی ایجاد کند. دوزهای کمتر به معنای هزینه های تولید کمتر است و تزریق های کمتر مکرر می تواند عوارض جانبی سمی بالقوه mRNA و حامل های تحویل را کاهش دهد. در حال حاضر، چندین کاندید saRNA وارد آزمایشات بالینی در سراسر جهان شده اند. شرکت های بزرگی مانند BioNTech به طور فعال در حال توسعه خطوط لوله فناوری saRNA هستند.

اگرچه saRNA مزایای هزینه و ایمنی قابل توجهی را ارائه می دهد، ساختار منحصر به فرد آن چالش های تولید جدیدی را ارائه می دهد. مولکول saRNA، که توالی کدکننده RNA پلیمراز را با توالی پروتئین هدف ترکیب می کند، بسیار بزرگتر (~ 10kb) و پیچیده تر (شامل ساختارهای ثانویه بیشتری) از mRNA سنتی است. این به طور قابل توجهی دشواری واکنش‌های رونویسی in vitro را افزایش می‌دهد و بازده و خلوص تولید saRNA را کاهش می‌دهد. بنابراین، تولید saRNA نیازمند استانداردهای بالاتر در فرآیندهای سنتز، جداسازی و خالص سازی است.

کروماتوگرافی میل ترکیبی، روشی که برای جداسازی و خالص‌سازی استفاده می‌شود، دارای مسائلی مانند عملکرد و یکپارچگی محصول هدف پایین است. ترکیب چندین روش خالص سازی کروماتوگرافی (به عنوان مثال، اضافه کردن کروماتوگرافی سلولزی، کروماتوگرافی فاز معکوس آبگریز) دست و پا گیر است، ناخالصی های جدیدی را معرفی می کند، نرخ بازیابی پایینی دارد و هزینه بر است. علاوه بر این، سیستم واکنش IVT که برای تولید در مقیاس بزرگ استفاده می‌شود، از سیستم‌های مناسب برای سنتز توالی‌های اسید نوکلئیک 100 nt بهینه شده است و آن را برای saRNA که اندازه آن بیش از 10 کیلوبایت است، نامناسب می‌کند. این امر بهینه سازی سیستم های واکنش IVT موجود را ضروری می کند. در حال حاضر، روش‌های متداول خالص‌سازی mRNA نمی‌توانند الزامات کیفیت مایع خام صنعتی را برآورده کنند. بنابراین، نیاز فوری به توسعه و بهینه‌سازی یک فرآیند جداسازی و خالص‌سازی صنعتی کامل و کارآمد برای RNA خودتقویت‌شونده وجود دارد.

بهینه سازی روش های تولید و تصفیه صنعتی

برای توسعه یک سیستم تولید صنعتی برای mRNA خودتقویت شونده (saRNA)، ابتدا باید انواع و اجزای یون بافر را در سیستم رونویسی IVT در مقیاس کوچک بهینه کرد. این همچنین شامل پالایش بافر کروماتوگرافی و نسبت شستشوی نمونه برای فرآیندهای تصفیه پایین دست است. سپس این شرایط بهینه را می توان تا تولید در مقیاس بزرگ افزایش داد تا بررسی شود که آیا سیستم می تواند به طور موثر ظرفیت تولید را افزایش دهد و کیفیت محصول خام را بهبود بخشد.

سیستم واکنش افزودن کلاهک رونویسی

در سیستم واکنش افزودن کلاهک رونویسی، اجزای بافر T7 شامل 400 میلی‌مولار HEPES، 20 میلی‌مولار اسپرمیدین، 100 میلی‌مولار DTT، و نمک‌های Mg2+ است.

بافر T7 - ​​نوع نمک یون منیزیم

نوع نمک یون منیزیم مورد استفاده بر عملکرد و یکپارچگی محصول saRNA هدف تأثیر می گذارد.

1. برای سنتز همزمان رونویسی در مقیاس کوچک mRNA 1 میلی گرم، استفاده از Mg(OAc)2 به عنوان نمک Mg2+ بهترین بازده و یکپارچگی را به ترتیب با مقادیر 100.5 میکروگرم و 62.9٪ به دست می آورد.
2. در مقابل، استفاده از سایر نمک های یون منیزیم مانند MgCl2 و MgSO4 عملکرد را تقریباً 25-50٪ و یکپارچگی را تا حدود 10٪ کاهش می دهد که به طور قابل توجهی عملکرد و یکپارچگی را کاهش می دهد.

بافر T7 - ​​غلظت یون منیزیم

غلظت بهینه یون‌های استات منیزیم (30-50 میلی‌مولار) بازده و یکپارچگی saRNA هدف را افزایش می‌دهد و بهترین نتایج را در 35 میلی‌مولار دارد.

1. در غلظت یون استات منیزیم 30-50 میلی مولار، بازده saRNA به 88.5-100.5 میکروگرم می رسد و یکپارچگی 58.6-62.9٪ است که نتایج خوبی را نشان می دهد.
2. در غلظت 35 میلی مولار، بازده و یکپارچگی در بالاترین حد خود هستند و به ترتیب به 100.5 میکروگرم و 62.9 درصد می‌رسند.

بافر T7 - ​​نمک یون منیزیم همراه با نمک های دیگر

افزودن نمک های دیگر به بافر T7 می تواند عملکرد و یکپارچگی محصول مورد نظر را به میزان قابل توجهی بهبود بخشد.

1. بافر پایه T7 شامل 400 میلی‌مولار HEPES، 20 میلی‌مولار اسپرمیدین، 100 میلی‌مولار DTT، و نمک‌های Mg2+ می‌باشد که منجر به بازده و یکپارچگی به ترتیب 100.5 میکروگرم و 62.9 درصد می‌شود.
2. افزودن نمک دوم، NaOAc، عملکرد و یکپارچگی را بیشتر افزایش می دهد: بازده 20-110 میکروگرم افزایش می یابد و یکپارچگی حدود 2-8٪ بهبود می یابد.

بافر T7 - ​​غلظت نمک های ترکیبی

هنگامی که دومین جزء نمک NaOAc (Na+) در غلظت 30-5 میلی مولار باشد، بازده و یکپارچگی saRNA هدف به طور قابل توجهی بهبود می‌یابد، با بهترین غلظت در 15 میلی‌مولار.

1. در غلظت های Na+ 3-30 میلی مولار، بازده saRNA به 120-210 میکروگرم می رسد و یکپارچگی 64.4-70.2 درصد است که نتایج خوبی را نشان می دهد.
2. در غلظت Na+ 15 میلی مولار، بازده و یکپارچگی در بالاترین حد خود هستند و به ترتیب به 210 میکروگرم و 70.2 درصد می‌رسند.

روشهای خالص سازی منفرد

در طی تولید و خالص‌سازی saRNA در مقیاس کوچک (<50 میلی‌گرم)، استفاده از روش‌های مختلف خالص‌سازی می‌تواند محتوای dsRNA و باقی‌مانده‌های پروتئین را به میزان قابل‌توجهی کاهش دهد و از راندمان بالا، راندمان دربندی و یکپارچگی محصول اطمینان حاصل کند. اثربخشی روش های خالص سازی از بهترین به بدترین عبارت است از: کروماتوگرافی میل ترکیبی > رسوب کلرید لیتیوم > اولترافیلتراسیون، کروماتوگرافی سلولزی.

1. کروماتوگرافی میل ترکیبی

برای تولید mRNA در مقیاس بزرگ، کروماتوگرافی ترجیح داده می شود. گزینه ها شامل فاز معکوس، تبادل یونی، کروماتوگرافی آبگریز و میل ترکیبی است که هر کدام مزایا و معایب خود را دارند. کروماتوگرافی میل ترکیبی، که اغلب برای گرفتن mRNA پلی(A) استفاده می‌شود، مقیاس‌پذیری و راه‌حل‌های پلتفرمی با نرخ بازیابی بیش از 90% ارائه می‌دهد.

ویژگی‌های ساختاری کلیدی mRNA، کلاهک 5' و دم پلی (A) 3'، تصفیه را تسهیل می‌کنند. کروماتوگرافی میل ترکیبی، مشابه خالص سازی مهره های مغناطیسی، از مهره های مرتبط با dT برای گرفتن mRNA دم پلی (A) استفاده می کند. شرایط نمک بالا از بارهای منفی محافظت می کند، و امکان اتصال از طریق پیوندهای هیدروژنی AT را فراهم می کند و mRNA تحت pH خنثی ملایم و رسانایی کم شسته می شود.

کروماتوگرافی میل ترکیبی برای RNA شامل "اتصال به نمک زیاد، شستشوی کم نمک" است. ترکیب بافر، اندازه مولکولی، دما و غلظت نمونه به طور قابل توجهی بر فرآیند تأثیر می گذارد. انتخاب نوع و غلظت بهینه نمک از طریق آزمایش برای تصفیه کارآمد ضروری است.

خالص‌سازی: این روش دارای بالاترین یکپارچگی محصول (80.3%)، کمترین محتوای dsRNA (0.01 میکروگرم بر میلی‌گرم)، بالاترین راندمان دربندی (96.4%) و کمترین باقی‌مانده پروتئین (1.20 میکروگرم بر میلی‌گرم)، با بازده 136 میکروگرم و نرخ بازیابی از نظر کیفیت و 65% بهترین محصول است.

2. سایر روش های تصفیه:

بارش لیتیوم کلرید

اصل خالص‌سازی mRNA با استفاده از LiCl این است که لیتیوم می‌تواند دافعه الکترواستاتیکی بین مولکول‌ها را در pH معین کاهش دهد و رسوب RNA کارآمد را ممکن می‌سازد.سپس رسوب با سانتریفیوژ جدا شده و برای به دست آوردن نمونه RNA خالص حل می شود. رسوب LiCl ساده، سریع، موثر برای mRNA های با اندازه های مختلف است و محصولاتی با خلوص بالا به دست می دهد. با این حال، یون های لیتیوم باقی مانده می توانند mRNA را مهار کنند. توصیه می شود از رسوب LiCl برای محلول های حاوی حداقل 400 میکروگرم بر میلی لیتر RNA استفاده شود تا از کارایی خالص سازی اطمینان حاصل شود. این روش بازده بالایی (210 میکروگرم) تولید می کند، اما یکپارچگی محصول تنها 70.2 درصد است که به طور قابل توجهی کیفیت محصول را کاهش می دهد. برای تولید در مقیاس بزرگ مناسب نیست.

روش مهره مغناطیسی:

دانه های مغناطیسی ذرات کوچکی هستند که به صورت جهت دار تحت یک میدان مغناطیسی حرکت می کنند که معمولاً از یک هسته اکسید آهن و یک پوشش خارجی تشکیل شده است. خالص سازی مهره مغناطیسی یک تکنیک متداول زیست شناسی مولکولی برای غنی سازی سریع و کارآمد مولکول های mRNA از مخلوط ها است. دانه‌های مغناطیسی عملکردی مختلف دارای گروه‌های عملکردی سطحی مختلفی هستند (به عنوان مثال، هیدروکسیل، کربوکسیل، الیگو(dT)، استرپتاویدین) برای خالص‌سازی مولکول‌های زیستی مختلف.

دانه های مغناطیسی کربوکسیله می توانند به طور موثر اسیدهای نوکلئیک را با مولکول های mRNA از طریق فعل و انفعالات الکترواستاتیک در شرایط اسیدی خالص کنند. تنظیم شرایط امکان اتصال و آزادسازی انتخابی mRNA را فراهم می کند. mRNA های طولانی تر با گروه های فسفات با بار منفی بیشتر به راحتی به دانه ها متصل می شوند. برای mRNA های کوتاه تر، ممکن است به حجم های بزرگتری نیاز باشد. مهره های مغناطیسی جفت شده با Oligo(dT)، مشابه کروماتوگرافی میل ترکیبی، از اتصال ویژه بین دم پلی(A) mRNA و Oligo(dT) مهره ها استفاده می کنند.

اولترافیلتراسیون

این روش منجر به کمترین یکپارچگی saRNA، تقریباً 8 درصد کمتر از کروماتوگرافی میل ترکیبی، با بالاترین باقیمانده پروتئین (4.58 میکروگرم بر میلی‌گرم) می‌شود.

کروماتوگرافی سلولزی

این روش به محتوای dsRNA کم (0.009 میکروگرم بر میلی‌گرم) و نرخ درپوش بالایی (96.4٪) دست می‌یابد. با این حال، باقیمانده های پروتئین کمی بالاتر هستند (5.30 میکروگرم بر میلی گرم)، با نرخ بازیابی تنها 57٪ و بازده 120 میکروگرم، که هر دو به طور قابل توجهی کمتر از آنچه با کروماتوگرافی میل ترکیبی به دست آمده است (به ترتیب حدود 10٪ و 16 میکروگرم) است.

فرآیند تصفیه

اجزای بافر کروماتوگرافی - افزودن عوامل کاهنده

افزودن عوامل کاهنده به بافر کروماتوگرافی در طول خالص سازی می تواند به طور قابل توجهی یکپارچگی محصول، سرعت بازیابی و کارایی پوشش را بهبود بخشد، در حالی که سطوح dsRNA محصول جانبی و باقی مانده های پروتئین را در مقایسه با عدم افزودن عوامل کاهنده کاهش می دهد.

1. بدون عوامل کاهنده:

- بازده: 136 میکروگرم

- میزان بازیابی: 65٪

- صداقت: 80.3٪

- dsRNA: 0.01μg/mg

- راندمان پوشش: 96.4٪

- باقی مانده پروتئین: 1.20 میکروگرم در میلی گرم

- خلوص و کیفیت محصول خوب است.

2. با عوامل کاهنده (TCPE، DTT، β-مرکاپتواتانول):

- عملکرد 10-40 میکروگرم افزایش می یابد

- نرخ بازیابی 5-18٪ افزایش می یابد

- صداقت تقریباً 1-5٪ بهبود می یابد

- راندمان پوشش: 96.4٪

- dsRNA: حداقل 0.005 میکروگرم بر میلی گرم

- باقیمانده پروتئین: حداقل 0.20 میکروگرم در میلی گرم

- بهبود قابل توجهی در خلوص و کیفیت محصول.

اجزای بافر کروماتوگرافی - انواع عوامل کاهنده

انواع مختلفی از عوامل کاهنده افزوده شده به بافر کروماتوگرافی می تواند یکپارچگی محصول، نرخ بازیابی و کارایی درپوش را بهبود بخشد و در عین حال dsRNA و باقیمانده پروتئین را کاهش دهد. TCPE موثرترین عامل کاهش دهنده است.

- با TCPE:

- بازده: 175 میکروگرم

- میزان بازیابی: 83٪

- صداقت: 85.2٪

- dsRNA: 0.005μg/mg

- راندمان پوشش: 96.4٪

- باقی مانده پروتئین: 0.20 میکروگرم در میلی گرم

- خلوص و کیفیت عالی محصول

اجزای بافر کروماتوگرافی - غلظت عوامل کاهنده

افزودن عوامل کاهنده در غلظت 5-15 میلی مولار در بافر کروماتوگرافی می تواند به طور قابل توجهی یکپارچگی محصول، نرخ بازیابی و کارایی درپوش را بهبود بخشد، در حالی که dsRNA و باقی مانده های پروتئین را کاهش می دهد. غلظت بهینه 10 میلی‌مولار است.

1. افزودن TCPE 5-15 میلی متر:

- عملکرد: 160-178 میکروگرم

- میزان بازیابی: 76-85٪

- صداقت: تقریباً 85٪

- dsRNA: 0.002-0.005μg/mg

- راندمان پوشش: 96.4٪

- باقی مانده پروتئین: 0.20-0.52μg/mg

- خلوص و کیفیت خوب محصول

2. با TCPE 10 میلی متر:

- بازده: 178 میکروگرم

- میزان بازیابی: 85٪

- صداقت: 85.4٪

- dsRNA: 0.002μg/mg

- راندمان پوشش: 96.4٪

- باقی مانده پروتئین: 0.20 میکروگرم در میلی گرم

- خلوص و کیفیت مطلوب محصول.

نسبت شستشو

کنترل نسبت بافر کروماتوگرافی به آب تزریقی در فرآیند شستشو (25-10): (90-75) می تواند به طور قابل توجهی یکپارچگی محصول، نرخ بازیابی و کارایی درپوش را بهبود بخشد، در حالی که dsRNA و باقی مانده های پروتئین را کاهش می دهد. نسبت بهینه 15:85 است.

1. نسبت (10-25):(75-90):

- عملکرد: 150-179 میکروگرم

- میزان بازیابی: 71-85٪

- صداقت: 84-90٪

- dsRNA: 0.002-0.006μg/mg

- راندمان پوشش: 96.4٪

- باقیمانده پروتئین: تقریباً 0.20 میکروگرم در میلی گرم

- خلوص و کیفیت خوب محصول

2. با نسبت 15:85:

- بازده: 179 میکروگرم

- میزان بازیابی: 85٪

- صداقت: 90.0٪

- dsRNA: 0.002μg/mg

- راندمان پوشش: 96.4٪

- باقی مانده پروتئین: 0.20 میکروگرم در میلی گرم

- خلوص و کیفیت مطلوب محصول.

روشهای تصفیه ترکیبی

استفاده از ترکیبی از روش‌های مختلف خالص‌سازی می‌تواند سطوح باقی‌مانده dsRNA و پروتئین را در محصول کاهش دهد و کیفیت کلی را افزایش دهد. ترتیب ترجیحی روش های خالص سازی عبارتند از: کروماتوگرافی میل ترکیبی > اولترافیلتراسیون + کروماتوگرافی میل ترکیبی > کروماتوگرافی میل ترکیبی + کروماتوگرافی سلولزی > کروماتوگرافی سلولزی + اولترافیلتراسیون. کروماتوگرافی میل ترکیبی به تنهایی بهترین نتایج را ارائه می دهد.

1. کروماتوگرافی میل ترکیبی به تنهایی:

- بازده: 179 میکروگرم

- میزان بازیابی: 85٪

- صداقت: 90.0٪

- dsRNA: 0.002μg/mg

- راندمان پوشش: 96.4٪

- باقی مانده پروتئین: 0.20 میکروگرم در میلی گرم

- بالاترین خلوص و کیفیت محصول.

2. اولترافیلتراسیون + کروماتوگرافی میل ترکیبی:

- بازده: 170 میکروگرم (9 میکروگرم کمتر از کروماتوگرافی میل ترکیبی به تنهایی)

- نرخ بازیابی: 81٪ (4٪ کمتر از کروماتوگرافی میل ترکیبی به تنهایی)

- صداقت: 88.5٪

- dsRNA: 0.0015μg/mg

- باقی مانده پروتئین: 0.18 میکروگرم بر میلی گرم

- کاهش جزئی در dsRNA و باقیمانده پروتئین در مقایسه با کروماتوگرافی میل ترکیبی به تنهایی، اما کاهش قابل توجه در بازده و سرعت بازیابی. این روش پیچیده تر است و زمان تصفیه را دو برابر می کند و هزینه ها را افزایش می دهد.

3. کروماتوگرافی میل ترکیبی + کروماتوگرافی سلولزی / کروماتوگرافی سلولزی + اولترافیلتراسیون:

- dsRNA: 0.005μg/mg کمتر از روش های تکی

- عملکرد: 60-100 میکروگرم کمتر

- نرخ بازیابی: 30-40٪ کمتر

- افزایش مراحل منجر به افزایش هزینه های نیروی کار و مواد می شود.

تولید در مقیاس بزرگ

در تولید در مقیاس بزرگ، با استفاده از کروماتوگرافی میل ترکیبی، کروماتوگرافی میل ترکیبی با کروماتوگرافی سلولزی، یا اولترافیلتراسیون همراه با کروماتوگرافی میل ترکیبی، بازده mRNA خودتقویت شونده به طور قابل توجهی به 140-185 میکروگرم با نرخ بازیابی 67-8% افزایش می یابد. یکپارچگی محصول 93-94٪ است، محتوای dsRNA در 0.0018-0.0020 میکروگرم بر میلی گرم کنترل می شود، راندمان پوشش به 96.1-96.4٪ می رسد و باقی مانده های پروتئین در محدوده 0.04-0.05 میکروگرم بر میلی گرم نگه داشته می شوند. این مقیاس پذیری و کارایی خوبی را برای تولید در مقیاس بزرگ نشان می دهد.

مرجع:

[1] بارش LiCl برای تصفیه RNA، بازیابی شده در 8 ژانویه 2024، از https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/references/ambion-techsupport/rna-isolation/general-articles/the-use-of-licl-precipitation-for-rna-purification.html.

[2] برگه اطلاعات محصول محلول بارش لیتیوم کلرید، بازیابی شده در 8 ژانویه 2024، از https://www.thermofisher.cn/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFSAssets%2FLSG%2Fmanuals%2F4386633_LithiumChloridePrecipSol_PI.pdf.

[3] محصول BeyoMag™ RNA Clean Magnetic Beads، بازیابی شده در 8 ژانویه 2024، از https://www.beyotime.com/product/R0081-1ml.htm.

[4] محصول VAHTS RNA Clean Beads، بازیابی شده در 8 ژانویه 2024، از https://www.vazyme.com/product/215.html.

[5] رونویسی در شرایط آزمایشگاهی فاز جامد مبتنی بر Dynabeads و خالص سازی RNA، بازیابی شده ژانویه 8،2024، از https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/cn/zh/65020D.

[6] RNA Clean XP Performance and Data، بازیابی شده در 8 ژانویه 2024، از https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/rna-and-cdna/performance.

[7] اخبار از ThermoFisher Scientific، بازیابی شده در 8 ژانویه 2024، از https://bydrug.pharmcube.com/news/detail/39287a37147e22e2d978f7dd9228df58.

[8] روشهای خالص سازی تولید صنعتی و جداسازی مایع خام mRNA خودتقویت شونده و کاربردهای آن [P]. ثبت اختراع: CN118048418A. 17.05.2024.

اطلاعات سفارش

Yeasen یک CleaScrip™ T7 RNA Polymerase را توسعه داد که یک آنزیم درجه یک برای سنتز mRNA است. زیرا دیگر نیازی به تصفیه سلولز برای حذف dsRNA نیست و در زمان و هزینه نیروی کار صرفه جویی می شود. محتوای dsRNA در mRNA های تولید شده توسط CleaScript™ T7 RNA پلیمراز کمتر از mRNA های تولید شده توسط RNA پلیمراز نوع وحشی T7 است، هم قبل و هم بعد از مرحله حذف dsRNA با استفاده از تیمار سلولزی. جزئیات بیشتر را بررسی کنید از لینک های زیر: